“眼見(jiàn)為實(shí)”的行為準(zhǔn)則在某種程度上極大促進(jìn)了人類(lèi)科學(xué)的發(fā)展，這也使得科學(xué)家們?cè)缭?658年就能用顯微鏡對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成像。從那時(shí)起，顯微鏡技術(shù)已經(jīng)顯著地現(xiàn)代化，并且隨著熒光顯微鏡和三維顯微鏡的使用，顯微鏡技術(shù)已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中無(wú)處不在的工具。

看到的信息越多，對(duì)細(xì)胞的認(rèn)識(shí)便更進(jìn)一步。隨著細(xì)胞成像技術(shù)的不斷發(fā)展，人類(lèi)正朝著能看到更多信息的方向邁進(jìn)。同時(shí)，看到更多的基礎(chǔ)上，成像的質(zhì)量也并不會(huì)受損失：顯微鏡工具可以在更高的分辨率下以驚人的精度獲得更多的信息，更重要的是，在最小擾動(dòng)下活細(xì)胞條件下觀察?？茖W(xué)家們現(xiàn)在可以常規(guī)地可視化單個(gè)細(xì)胞器，繪制染色體位點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)圖，感知機(jī)械力，并連續(xù)幾天以高通量的方式成像細(xì)胞。接下來(lái)，將從五個(gè)方面介紹細(xì)胞顯微成像技術(shù)的最新進(jìn)展，以進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該領(lǐng)域的發(fā)展方向。

1、布里淵光學(xué)顯微鏡（Brillouin microscopy）

布里淵顯微鏡是一種非侵入性、無(wú)標(biāo)簽的方法，可以在三維空間中以衍射限制分辨率探測(cè)生物樣品的粘彈性性質(zhì)。區(qū)別于原子力顯微鏡，它的優(yōu)點(diǎn)是不接觸。在病變組織中，細(xì)胞和組織的力學(xué)特性經(jīng)常發(fā)生改變，因此對(duì)理解病理學(xué)機(jī)制具有重要意義。布里淵光散射是圍繞光與自發(fā)熱致密度波動(dòng)的相互作用而展開(kāi)的。從散射光譜2的頻移可以推斷出諸如剛度的機(jī)械特性。這使得許多類(lèi)型的生物測(cè)量成為可能，例如全細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)生物力學(xué)特性的3D映射，或腸的成像。然而，用這種顯微鏡技術(shù)仍然有待解決的挑戰(zhàn)，數(shù)據(jù)需要特別仔細(xì)的解讀，因?yàn)橐恍┤苏J(rèn)為布里淵測(cè)量可能主要由水化作用而不是剛度效應(yīng)來(lái)決定的。

2、CRISPR標(biāo)記熒光成像（CRISPR-labeled fluorescence imaging）

CRISPR無(wú)疑已經(jīng)徹底改變了基因編輯和調(diào)控，在這一過(guò)程中，它也促進(jìn)了細(xì)胞顯微鏡技術(shù)的發(fā)展。與僅對(duì)固定細(xì)胞成像的常規(guī)原位雜交研究相反，研究小組已經(jīng)用它來(lái)標(biāo)記已定義的染色體位點(diǎn)，以便在活細(xì)胞中成像基因組的三維結(jié)構(gòu)。利用Cas9和單導(dǎo)向RNA(sgRNA)結(jié)合熒光蛋白，Ma等人最近實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)活細(xì)胞中多達(dá)6個(gè)染色體位點(diǎn)的同步成像，他們稱(chēng)之為CRISPRainbow技術(shù)。原則上，他們解釋說(shuō)，只要在CRISPRainbow上再添加一種顏色，就可以將同時(shí)檢測(cè)基因組位點(diǎn)的活細(xì)胞數(shù)量增加到15個(gè)。

3、光片顯微鏡（Light sheet microscopy）

光片熒光顯微鏡(LSFM)只照亮樣品的薄成像焦平面，并檢測(cè)來(lái)自該特定平面的熒光，從而最大限度地減少離焦熒光和光漂白。這意味著無(wú)需切片就能觀察到生物體和細(xì)胞的動(dòng)態(tài)。直到最近，分辨率還不允許亞細(xì)胞成像的視野大到足以容納幾個(gè)細(xì)胞。事實(shí)上，組織的光學(xué)異質(zhì)性會(huì)導(dǎo)致像差，隨著成像深度的增加，像差會(huì)迅速影響分辨率、信號(hào)和對(duì)比度。雖然貝塞爾光束和點(diǎn)陣光片已經(jīng)取得了進(jìn)展，但這種技術(shù)仍然復(fù)雜且昂貴。在2019年，Chang等人描述了一種新的場(chǎng)合成方法，它有助于使用更簡(jiǎn)單的光學(xué)器件的光片。這種方法將LSFM與自適應(yīng)光學(xué)相結(jié)合，通過(guò)改變鏡子的形狀來(lái)產(chǎn)生相等但相反的畸變，從而補(bǔ)償光學(xué)畸變。它需要更少的功率，最大限度地減少光漂白，并允許在同一時(shí)間以高分辨率成像多種顏色。這使得Liu等人能夠通過(guò)檢測(cè)角蛋白包被的凹坑在人類(lèi)干細(xì)胞衍生的類(lèi)器官或斑馬魚(yú)的背尾區(qū)域中的擴(kuò)散，在納米尺度上對(duì)內(nèi)吞作用進(jìn)行成像。并幫助他們?cè)诎唏R魚(yú)胚胎發(fā)生過(guò)程中用細(xì)節(jié)細(xì)胞器動(dòng)態(tài)顯示，和體內(nèi)神經(jīng)元，癌癥或免疫細(xì)胞的3D細(xì)胞遷移。這一突破有望徹底改變定量亞細(xì)胞4D細(xì)胞生物學(xué)。

4、全息斷層掃描顯微鏡（Holo-tomographic microscopy）

全息斷層掃描顯微鏡（HTM）是一種定量相位顯微鏡方法，其中物體的復(fù)雜波場(chǎng)被編碼成全息圖，并且與樣本的旋轉(zhuǎn)掃描相結(jié)合。這導(dǎo)致快速三維重建的實(shí)時(shí)樣品的折射率分布的分辨率低于Rayleigh準(zhǔn)則定義的光的衍射極限。該技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)是它傳輸給樣品的能量低，確保低光毒性，允許在不受干擾的情況下研究亞細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。無(wú)散射系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)，允許亞細(xì)胞高分辨率成像，例如通過(guò)融合和裂變循環(huán)的單個(gè)線粒體成像。使用這種技術(shù)，Sandoz等人首次報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞(mESCs)有絲分裂前細(xì)胞重組的細(xì)胞器旋轉(zhuǎn)。在有絲分裂前80分鐘，他們觀察細(xì)胞核、核仁、核膜、脂滴和線粒體的旋轉(zhuǎn)，這表明細(xì)胞分裂前物質(zhì)重新分布的潛在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

5、高內(nèi)涵分析顯微鏡（High content-analysis microscopy）

看得更多不僅僅是為了達(dá)到高分辨率，它還意味著看得更久?？茖W(xué)家們意識(shí)到，短時(shí)間成像細(xì)胞，或在離散時(shí)間點(diǎn)成像細(xì)胞，可能意味著它們錯(cuò)過(guò)了關(guān)鍵的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)。這就是為什么現(xiàn)在開(kāi)發(fā)的系統(tǒng)可以對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)成像。一方面，一些顯微鏡正在開(kāi)發(fā)中，它們可以集成在孵卵器中，隨著細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，它們可以在二維時(shí)間內(nèi)追蹤細(xì)胞。類(lèi)似地，一些培養(yǎng)箱被設(shè)計(jì)成包含攝像機(jī)，可以對(duì)任何測(cè)試進(jìn)行連續(xù)成像，從而能夠在同一個(gè)培養(yǎng)箱中對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行成像。另一方面，為了設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)豐富的實(shí)驗(yàn)，目前正在開(kāi)發(fā)高通量系統(tǒng)，以便能夠長(zhǎng)時(shí)間地研究孔板中的更多細(xì)胞分析。例如，Anastasov等人培養(yǎng)了大量由癌癥和基質(zhì)細(xì)胞組成的腫瘤球體，并對(duì)其成像14天，以量化它們?cè)诓煌暖熀突熃M合下的生長(zhǎng)。這種高含量的裝置使他們能夠篩選大量的化療藥物，以及它們與輻射的結(jié)合，從而確定長(zhǎng)春堿是一種射電致敏劑，與單獨(dú)使用長(zhǎng)春堿的試驗(yàn)相比，它在減小球體大小方面更有效。

相關(guān)儀器專(zhuān)場(chǎng)：【光學(xué)顯微鏡專(zhuān)場(chǎng)】

相關(guān)文獻(xiàn)

1. Hajdu, S. I. (2003). A note from history: The discovery of blood cells. Ann. Clin. Lab. Sci. 33, 237–8.

2. Prevedel R et al. (2019). Brillouin microscopy – a revolutionary tool for mechanobiology? arXiv: 1901.02006.

3. Antonacci, G., de Turris, V., Rosa, A. & Ruocco, G. (2018). Background-deflection Brillouin microscopy reveals altered biomechanics of intracellular stress granules by ALS protein FUS. Commun. Biol. 1, 139.

4. Wu et al. (2018). Water content, not stiffness, dominates Brillouin spectroscopy measurements in hydrated materials. Nat Methods. 15(8):561-562.

5. Chen, B. et al. (2013). Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell 155, 1479–1491.

6. Ma et al. (2016). Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nature Biotechnology. 34(5):528-30.

7. Forero-Shelton M. (2019). Peering into cells at high resolution just got easier Nat Methods. Apr;16(4).

8. Chang, BJ. et al. (2019). Universal light-sheet generation with field synthesis. Nat. Methods 16, 235–238.

9. Liu et al. (2018). Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360, 284.

10. Sandoz P.A et al. (2018). Label free 3D analysis of organelles in living cells by refractive index shows pre-mitotic organelle spinning in mammalian stem cells. BioArxiv.

11. Anastasov, N. et al. (2015). A 3D-microtissue-based phenotypic screening of radiation resistant tumor cells with synchronized chemotherapeutic treatment. BMC Cancer 15, 466.