評(píng)估RNA 完整性是獲得有意義基因表達(dá)數(shù)據(jù)的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。采用完整RNA 是成功微陣列或 qRT-PCR 分析的關(guān)鍵要素。Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)和 RNA 試劑盒在協(xié)助研究者確定 RNA 質(zhì)量方面發(fā)揮重要作用。Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)上生成的譜圖包括濃度信息，允許直觀檢查RNA 完整性，并生成核糖體比率。本應(yīng)用簡(jiǎn)報(bào)描述的新軟件算法開(kāi)發(fā)用于從生物分析儀電泳圖提取RNA 樣品完整性的信息。
前言
確定RNA 起始材料的完整性是基因表達(dá)分析中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)及相關(guān)的 RNA 6000 Nano 試劑盒和 Pico 試劑盒已成為RNA 質(zhì)量評(píng)估和定量的標(biāo)準(zhǔn)1,2。在精密加工的芯片上利用電泳分離，分離RNA 樣品，并隨后通過(guò)激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法檢測(cè)。生物分析儀軟件生成電泳圖和凝膠樣圖像，并展示多種結(jié)果，如樣品濃度和核糖體比率。電泳圖提供了RNA 樣品質(zhì)量的詳細(xì)直觀評(píng)估結(jié)果。然而，依賴人工目視解釋數(shù)據(jù)的方 法具有內(nèi)在缺陷。此前，研究者們 已經(jīng)將核糖體比率在平板凝膠分析 中并作為特征在生物分析儀軟件中 用來(lái)表征RNA 完整性的狀態(tài)。采用核糖體比率的總RNA 樣品平板凝膠分析通常得到不準(zhǔn)確的RNA 完整性評(píng)估結(jié)果3。通過(guò)顯示 RNA 片段大小分布的詳細(xì)畫(huà)面，Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)提供更好的RNA 完整性評(píng)估結(jié)果。
圖 1
總RNA 樣品經(jīng)過(guò)不同時(shí)間降解，并且在Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)上使用真核細(xì)胞總RNA Nano 分析法分析所得的樣品。隨著降解推進(jìn)，可以觀察到向較短片段大小方向偏移 RNA 降解是一個(gè)逐漸的過(guò)程。隨著降解推進(jìn)（圖 1），18S/28S 核糖體條帶比減小，而兩個(gè)核糖體峰和下位內(nèi)標(biāo)之間的基線信號(hào)增大。生物分析儀軟件自動(dòng)生成 18S/28S 核糖體亞基的比率。盡管核糖體比率在確定凝膠電泳中樣品降解程度方面發(fā)揮重要作用，但Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中更詳細(xì)的分析表明， 該比率未充分描述樣品完整性。
為了將RNA 完整性解釋過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化， 安捷倫科技有限公司已經(jīng)推出一種新的RNA 質(zhì)量評(píng)估工具。開(kāi)發(fā)RNA 完整值 (RIN) 旨在消除 RNA 質(zhì)量控制中的個(gè)人解釋。它將完整電泳圖納入考量。基于 1 至 10 的編號(hào)系統(tǒng)，RIN 軟件算法可將真核生物總 RNA 分類(lèi)，其中 1 代表降解最嚴(yán)重的情況并且 10 代表最完整。通過(guò)這種方式，有助于解釋電泳圖，令樣品比 較成為可能，并確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。
RIN 工具的開(kāi)發(fā)
RIN 軟件算法針對(duì) Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中用真核生物總 RNA Nano 分析法采集的樣品開(kāi)發(fā)。輸入數(shù)據(jù)包括來(lái)自三個(gè)哺乳動(dòng)物物種（人類(lèi)、小鼠和大鼠）的不同組織中約 1300 份總 RNA 樣品，所有樣品的完整程度各不相同。RNA 樣品的分類(lèi)由應(yīng)用專(zhuān)家手動(dòng)進(jìn)行，他們將每份總RNA 樣品分類(lèi)至 1-10 的預(yù)定編號(hào)系統(tǒng)。圖 2 展示了不同 RIN 類(lèi)別的代表性電泳圖（編號(hào)分別為10、6、3、2）。

圖2
用于調(diào)試RNA 完整值(RIN) 軟件的樣品電泳圖。樣品為完整樣品(RIN 10) 至降解樣品(RIN 2)
為開(kāi)發(fā) RIN 算法，采用了神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等自適應(yīng)學(xué)習(xí)工具（工具由Quantiom Bioinformatics 提供）。這些工具允許確定可以從電泳圖提取的關(guān)鍵特征。這些特征是可以采用
合適積分儀分析的電泳圖組成部分。它們可以是信號(hào)面積、強(qiáng)度、比值等。圖 3 中列出電泳圖的重要要素。他們包括不同的區(qū)域（前區(qū)、5S區(qū)、快速區(qū)、中區(qū)、前體區(qū)、后區(qū)）和峰（標(biāo)準(zhǔn)品、18S、28S）。

圖 3
詳述提示RNA 質(zhì)量的各區(qū)域的電泳圖
  RIN 可視化
先前版本生物分級(jí)軟件中存在的數(shù)據(jù)可以同樣存在于下一版 Expert 軟件中，例如RNA 面積、RNA 濃度和rRNA 比率。RIN 軟件包括 RIN 值（圖 4），該值可以表述為小數(shù)或整數(shù)。RIN 值可以在 全局高級(jí) 設(shè)置下的 設(shè)點(diǎn)瀏覽器 中的 分析性質(zhì) 選項(xiàng)卡中從小數(shù)變?yōu)檎麛?shù)。如果軟件在某些區(qū)域發(fā)現(xiàn)意外的峰或信號(hào)，可能無(wú)法計(jì)算RIN 值。

圖4
Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)Expert 軟件中的RIN 可視化。 結(jié)果 選項(xiàng)卡中顯示 RIN 值， 而 錯(cuò)誤 選項(xiàng)卡將包含在RIN 未計(jì)算情況下有用的信息
這將產(chǎn)生提示已檢測(cè)到異常的錯(cuò)誤 消息（列在軟件的錯(cuò)誤選項(xiàng)卡中）。異常包括基因組DNA 污染、鬼峰、尖峰和波浪狀基線。異常可以分為兩類(lèi)：關(guān)鍵和非關(guān)鍵。非關(guān)鍵異常（如后區(qū)的尖峰）將導(dǎo)致計(jì)算 RIN 值， 而關(guān)鍵異常（如快速區(qū)的尖峰）將 導(dǎo)致 RIN 值無(wú)法計(jì)算。如果認(rèn)定某個(gè)異常非關(guān)鍵（如基因組污染，此 事應(yīng)當(dāng)進(jìn)行DNA 酶消化以獲取有意義的數(shù)據(jù)），對(duì)于已經(jīng)標(biāo)記的樣品，仍可以通過(guò)在 設(shè)點(diǎn)瀏覽器 的高級(jí)設(shè)置中提高異常閾值設(shè)定，計(jì)算RIN 值（圖 5）。異常閾值檢測(cè)的最大值為 1。錯(cuò)誤消息的描述將與適當(dāng)閾值相對(duì)應(yīng)。

圖5
改變異常閾值和RIN 單位小數(shù)表示。如果分析期間已經(jīng)檢測(cè)到關(guān)鍵異常，則在許多情況下仍可以通過(guò)提高閾值（最大值為 1）計(jì)算RIN 值。可以在 錯(cuò)誤 選項(xiàng)卡中找到關(guān)于異常的信息
利用RIN 得到的結(jié)果
開(kāi)發(fā) RIN 軟件以消除依賴用戶的RNA 質(zhì)量解釋過(guò)程?？俁NA 樣品的表征基本上與儀器、樣品濃度和操作者無(wú)關(guān)，從而允許跨不同實(shí)驗(yàn)室比較樣品。
RNA 完整性
圖 6 展示三份完整程度狀態(tài)不同的RNA 樣品。RIN 工具賦予三種不同命名，代表相應(yīng)的完整性。在樣品與調(diào)試算法時(shí)所用樣品不同的大型驗(yàn)證研究期間，得到了可靠的樣品分類(lèi)。

圖6
在完整程度不同的樣品上檢驗(yàn)RNA 完整值。RIN 軟件算法能夠?qū)悠肪_分類(lèi)
核糖體比率
圖 7 顯示了在三臺(tái)不同儀器上分析
的同一份人腦 (Ambion, Inc.) 總 RNA 樣品，并且顯示了儀器 1 和儀器 3 的代表性電泳圖。將采用生物分析 儀軟件生成的核糖體比率與 RIN 值比較。對(duì)于 36 份樣品，與 RIN 值相比，采用核糖體比率時(shí)變異程度較 大。RIN 計(jì)算值的變異系數(shù)為 1.4%， 而核糖體比率的變異系數(shù)為 5.1%。謹(jǐn)記這些CV 值指向相同樣品。當(dāng)納入來(lái)自不同物種和組織的樣品時(shí)， 發(fā)現(xiàn)核糖體比率的CV值顯著增大。

圖7
三臺(tái)不同儀器上分析 36 份總RNA 樣品。將RIN 與核糖體比率比較。RIN 工具的CV 顯著低于核糖體比率
分析不同稀釋度的樣品時(shí)，獲得了類(lèi)似圖像（圖 8）。將小鼠腦總 RNA 稀釋為三個(gè)不同濃度：25 ng/ L、 100 ng/ L 和 500 ng/ L。對(duì)于測(cè)試的 108 份樣品中，RIN 值大幅度優(yōu)于核糖體比率。RIN的變異系數(shù)為3%，而核糖體比率的變異系數(shù)則為 22%。應(yīng)當(dāng)指出，低于 25 ng/ L時(shí)，不能獲得準(zhǔn)確的RIN 值。對(duì)于大于 50 ng/ L 的樣品濃度，獲得最佳結(jié)果。

圖8
檢驗(yàn)不同稀釋程度的同一份RNA 樣品時(shí)，以狹窄限值范圍獲得相同的RIN  值，而核糖體比率顯示重現(xiàn)性差得多
利用RIN
RIN 是測(cè)量 RNA 完整性的一款強(qiáng)大的新工具。圖 9 中的圖示給出了RIN 的最佳實(shí)際使用案例。作為第一步，應(yīng)當(dāng)驗(yàn)證 RIN 值（圖 9A）。這可以通過(guò)將 RIN 值與特定下游實(shí)驗(yàn)如微陣列分析或RT-PCR 關(guān)聯(lián)來(lái)進(jìn)行?？梢岳眠@個(gè)關(guān)聯(lián)步驟在成功的下游實(shí)驗(yàn)和失敗的實(shí)驗(yàn)間建立RIN 閾值。可以在現(xiàn)有生物分析儀數(shù)據(jù)集合（如可獲得）上進(jìn)行此步驟。在已經(jīng)建立閾值后，這個(gè)值可以用 于標(biāo)準(zhǔn)RNA 質(zhì)量控制程序（圖 9B）。RIN 高于閾值的所有樣品通過(guò)QC 檢驗(yàn)，而丟棄RIN 低于閾值的樣品。如果重要實(shí)驗(yàn)參數(shù)變更（例如，研究不同的生物、使用不同類(lèi)型的微陣列、采用不同的探針集等），則應(yīng)當(dāng)重復(fù)驗(yàn)證 RIN 的關(guān)聯(lián)步驟。截至目前，已采用真核生物總 RNA Nano 分析法檢驗(yàn)RIN 算法。
圖 9
A. 將RIN 值與下游實(shí)驗(yàn)（例如微陣列或RT-PCR）關(guān)聯(lián)并確定獲得有用基因表達(dá)結(jié)果的閾值
B. 在已經(jīng)進(jìn)行初始關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)并已經(jīng)設(shè)定數(shù)據(jù)閾值后，RIN 值可以用于丟棄在Agilent 2100 生物分析儀系統(tǒng)中未通過(guò)樣品Q(chēng)C 的樣品（RIN 值低于閾值） RIN 局限性
RIN 旨在提供明確的 RNA 完整性評(píng)估結(jié)果。給出了樣品完整性的衡量標(biāo)準(zhǔn)，它可用于直接比較運(yùn)輸前后的樣品，或用于比較不同實(shí)驗(yàn)室間的樣品。最重要的是，它可以用來(lái)確?；虮磉_(dá)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，只要涉及樣品提取步驟。然而，在無(wú)前期驗(yàn)證工作的情況下，RIN 不能預(yù)測(cè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的效能。例如，一份樣品可能過(guò)度降解而無(wú)法進(jìn)行全基因組微陣列實(shí)驗(yàn)，但可能產(chǎn)生良好的 RT-PCR 數(shù)據(jù)。為了有效利用RIN，必須進(jìn)行必要的關(guān)聯(lián)工作。
結(jié)論
我們已經(jīng)設(shè)計(jì)出一款能夠比核糖體比率更好評(píng)估 RNA 質(zhì)量的軟件算法。RIN 工具是 RNA 完整性評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)化的重要環(huán)節(jié)。研究者不再受困于總 RNA 的主觀分類(lèi)。通過(guò)進(jìn)行關(guān)聯(lián)實(shí)驗(yàn)，可創(chuàng)建閾值以確保實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) RIN 工具基本上沒(méi)有儀器變異性及濃度變異性， 因此有助于儀器間及實(shí)驗(yàn)室間樣品的比較。
參考文獻(xiàn)
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致謝
我們要特別感謝合作伙伴 Ambion
Inc.、德國(guó)基因組研究資源中心
(RZPD) 以及 Quantiom Bioinformatics。我們還要特別感謝對(duì) RIN 算法進(jìn)行內(nèi)部測(cè)試并提供寶貴意見(jiàn)的所有研究人員。