近日，華中科技大學(xué)的研究人員報告稱，多發(fā)性骨髓瘤的細(xì)胞外囊泡（MM-EV）有望作為新型的生物標(biāo)志物，應(yīng)用于骨髓瘤骨病的診斷和治療。

這篇題為 Tumor-derived extracellular vesicles inhibit osteogenesis and exacerbate myeloma bone disease 的文章于1月發(fā)表在《Theranostics》雜志（IF: 8.537）上。華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院的李秋柏教授和生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院的郭安源教授為共同通訊作者。

背景介紹

在我國，多發(fā)性骨髓瘤（MM）的發(fā)病率已超過急性白血病，位居血液系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位。大約80%的患者會出現(xiàn)骨髓瘤骨?。∕BD），嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量及生存期。MBD的特點在于成骨細(xì)胞活性嚴(yán)重受損，這是因為骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSC）成骨功能受阻。不過，受阻的具體機制還不太清楚。

最近，越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞外囊泡（EV）是以往被忽略的細(xì)胞間通訊機制。癌細(xì)胞會釋放含有多種分子的細(xì)胞外囊泡，如蛋白質(zhì)、RNA和miRNA，影響腫瘤微環(huán)境。于是，研究人員此次研究了骨髓瘤細(xì)胞外囊泡（MM-EV）的生物活性成分，并檢測了它對BM-MSC成骨功能以及骨髓瘤骨病的影響。

MM-EV富含調(diào)節(jié)MBD的各種分子

研究人員從人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系RPMI 8226和U266中分離出MM-EV，分別稱之為R-EV和U-EV。這些EV為球形，大小在200-1000 nm。它們是CD138、Annexin-V和PKH-26陽性的，同時表達(dá)EV標(biāo)志物Alix、TSG101、CD63、MFGE8或CD9。

之后，他們對R-EV中的RNA分子進(jìn)行測序。由于miRNA被選擇性分泌到EV中，并充當(dāng)主要調(diào)節(jié)因子，他們重點分析了R-EV中包含的miRNA，并與來自B細(xì)胞和K562白血病細(xì)胞的EV進(jìn)行比較。R-EV表達(dá)了287種miRNA，而K562-EV表達(dá)176種miRNA。

他們發(fā)現(xiàn)，一些調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的miRNA在R-EV和K562-EV中高表達(dá)。有意思的是，一些參與成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞分化的miRNA只在R-EV中高表達(dá)，如miR-103a-3p、miR-181a-3p和miR-21-3p。這些結(jié)果表明，R-EV所包含的miRNA不僅在細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用，還與骨髓瘤骨病的發(fā)展相關(guān)。

MM-EV在體外抑制BM-MSC的成骨功能

接著，研究人員試圖確定MM-EV是否會影響B(tài)M-MSC的成骨功能。他們用80%成骨分化培養(yǎng)基和20%未過濾MM細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI 8226、U266和KM3）或條件細(xì)胞培養(yǎng)基（通過離心和過濾去除EV）處理BM-MSC。21天后，通過染色檢查BM-MSC的成骨細(xì)胞克隆數(shù)CFU-OB，他們觀察到未過濾的培養(yǎng)基比條件培養(yǎng)基具有更明顯的抑制作用。這些結(jié)果表明，EV對BM-MSC發(fā)揮成骨抑制作用。其中，原代BM-MSC及成骨分化培養(yǎng)基購自賽業(yè)生物。

他們隨后用來自RPMI 8226（R-EV）、U266（U-EV）或KM3（K-EV）細(xì)胞的MM-EV直接處理BM-MSC。他們發(fā)現(xiàn)，BM-MSC經(jīng)過MM-EV處理后的成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于對照，其中，R-EV發(fā)揮最大的抑制作用。接著，他們檢測了成骨相關(guān)生物標(biāo)志物的改變。他們發(fā)現(xiàn)，四種基因（RUNX2、ALP、osteocalcin和collagen I）的表達(dá)水平被一種或所有的MM-EV明顯拉低。這些結(jié)果確認(rèn)了MM-EV抑制BM-MSC的成骨功能（圖1）。

圖1. MM-EV抑制BM-MSC的成骨功能

既然miRNA在調(diào)節(jié)成骨中發(fā)揮了重要作用，那么MM-EV是否誘導(dǎo)BM-MSC的miRNA表達(dá)變化？研究人員之后通過miRNA測序分析了這一點。他們發(fā)現(xiàn)，BM-MSC經(jīng)過MM-EV處理后，變化最大的miRNA包括miR-181a-3p、miR-21-3p、miR-103a-3p和miR-107，其中miR-103a-3p對于成骨至關(guān)重要。通過實時定量PCR證實，R-EV誘導(dǎo)BM-MSC中miR-103a-3p的高表達(dá)。這表明此種miRNA可能與成骨抑制作用有關(guān)。

MM-EV讓小鼠模型的骨髓瘤骨病惡化

之后，研究人員開展了體內(nèi)研究。他們將RPMI 8226細(xì)胞和/或R-EV直接注射到脛骨，建立了小鼠模型。Micro-CT顯示，MM-EV組和MM組左脛骨骨干的骨密度等各項指標(biāo)都明顯低于對照組。染色結(jié)果也表明了嚴(yán)重的骨破壞和MM細(xì)胞浸潤，以及MM組和MM+MM-EV組的成骨細(xì)胞更多，破骨細(xì)胞更少。這些結(jié)果說明，單次注射R-EV可以降低小鼠脛骨的成骨功能，與體外研究結(jié)果一致（圖2）。

此外，R-EV還可以增強MM細(xì)胞的活性，加劇MM細(xì)胞誘導(dǎo)的成骨功能降低，并顯著增加MM誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。這些結(jié)果支持了R-EV推動小鼠模型的疾病進(jìn)展。

圖2. 小鼠脛骨的Micro-CT分析

外周血CD138+ cirEV水平指示骨病變

最后，研究人員從新發(fā)骨髓瘤患者的外周血中分離出cirEV，以評估cirEV水平與BMD及其他骨髓瘤臨床特征之間的關(guān)聯(lián)。他們發(fā)現(xiàn)，CD138+ cirEV計數(shù)能夠區(qū)分新發(fā)患者和健康供體。對于骨髓瘤骨病，他們還發(fā)現(xiàn)CD138+ cirEV計數(shù)與骨病變的數(shù)量有關(guān)，存在0處、 3處和 3處骨病變的患者在結(jié)果上明顯不同。這些結(jié)果表明，外周血CD138+ cirEV計數(shù)是骨髓瘤骨病的潛在診斷標(biāo)志物。

雖然以往的研究認(rèn)為細(xì)胞外囊泡在骨髓瘤中發(fā)揮了不同作用，但我們提出首個證據(jù)，表明MM-EV在體外抑制BM-MSC的成骨功能，并讓小鼠的骨髓瘤骨病惡化，而外周血CD138+ cirEV對骨髓瘤骨病具有診斷意義， 作者在文中總結(jié)道。

原文檢索

Zhang L, Lei Q, Wang H, Xu C, Liu T, Kong F, Yang C, Yan G, Sun L, Zhao A, Chen W, Hu Y, Xie H, Cao Y, Fu F, Yuan G, Chen Z, Guo AY, Li Q. Tumor-derived extracellular vesicles inhibit osteogenesis and exacerbate myeloma bone disease. Theranostics 2019; 9(1):196-209. doi:10.7150/thno.27550.