B淋巴細(xì)胞受外來抗原刺激后可以分泌抗體，不同的B淋巴細(xì)胞分泌的抗體不同，每個B淋巴細(xì)胞只分泌一種抗體；但是，B淋巴細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下存活時間很短，zui多2周 然后很快死亡。用于融合的骨髓瘤細(xì)胞不分泌任何免疫球蛋白(Ig)，是一種細(xì)胞系，能在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)分裂、長期存活。雜交瘤細(xì)胞便是將這兩種細(xì)胞的特性結(jié)合起來，獲得既能分泌單一抗體又能在體外長期培養(yǎng)的細(xì)胞。因此，分泌一種抗體，即單克隆抗體的雜交窄細(xì)胞便稱為雜交瘤細(xì)胞株。

建立雜交瘤細(xì)胞的全程技術(shù)稱為雜交瘤技術(shù)，一般需要4～6個月，包括以下階段：融合前所需細(xì)胞的準(zhǔn)備、細(xì)胞融合或細(xì)胞雜交、雜交瘤細(xì)胞篩選、雜交瘤細(xì)胞株的凍存。

(一)融合前所需細(xì)胞的準(zhǔn)備

1．動物免疫準(zhǔn)備脾細(xì)胞

動物體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞在特定外來抗原的刺激下，可以大量增殖變成漿細(xì)胞以分泌針對于該抗原的抗體。脾內(nèi)不同的B淋巴細(xì)胞可分泌針對抗原的不同抗原決定簇位點的抗體。當(dāng)受到特定外來抗原刺激時，相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞克隆便大量增殖以分泌相應(yīng)的特異性抗體。動物免疫的作用就是用特定外來抗原對動物進(jìn)行一次或多次免疫，以刺激能分泌針對于該抗原抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖．從而得到大量的專一B淋巴細(xì)胞。

動物免疫的方法很多，一般有常規(guī)免疫法、脾內(nèi)一次性免疫法、短程免疫法和體外免疫法等。脾內(nèi)一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐劑且所得單克隆抗體的特異性較高等特點。

由于單次免疫抗原刺激后數(shù)日內(nèi)就進(jìn)行細(xì)胞融合，因此不存在所謂 優(yōu)勢克隆 的問題，從而更容易獲得多種不同特異性的單克隆抗體，也能助于篩選出差別微小的兩種抗原的單克隆抗體。但該方法的缺點是，其免疫效果要等雜交瘤篩選時才明了，因此在實驗時有一定的隨機(jī)性。此外對一些免疫原性較差的抗原，分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選較困難。

常規(guī)免疫法比較可靠，在融合前能通過測定血清中的抗體滴度來證實免疫效果，因此實驗成功的把握性較大。由于免疫動物多次反復(fù)接受相同抗原的刺激，會使某些特定的淋巴細(xì)胞克隆大量增殖，易形成 優(yōu)勢克隆 ，因此產(chǎn)生分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞種類較少，很可能多個克隆所產(chǎn)生的單克隆抗體都是針對于同一個抗原決定簇的。免疫程序太長，費時費力。短程免疫法和體外免疫法均各有其優(yōu)缺點。

典型的免疫程序包括初次免疫、二次免疫和加強(qiáng)免疫，一般需要2～3個月時間。加強(qiáng)免疫前，用免疫抗原構(gòu)建試劑盒測定免疫動物的血清抗體滴度，符合融合需要時，在融合前3～4d進(jìn)行加強(qiáng)免疫。前2次免疫均可腹腔注射免疫，加強(qiáng)免疫采用脾內(nèi)注射方法。

脾內(nèi)注射的方法是，無菌打開小鼠腹腔，暴露出脾臟，用1ml無菌注射器將含有適量抗原的O．1ml溶液分別注射到兩只小鼠脾臟內(nèi)。然后將脾臟輕輕復(fù)位，縫合傷口，正常或加強(qiáng)營養(yǎng)進(jìn)行飼養(yǎng)備用。

2．對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備

在鼠源雜交瘤技術(shù)中，常用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞為SP2/O Agl4，簡稱sP2/O。也有使用Nsl細(xì)胞的，與SP2/0一樣，都是不分泌Ig的小鼠骨髓瘤細(xì)胞。

采用體外培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞，或?qū)⒐撬枇黾?xì)胞接種到健康動物皮下生長實體瘤的方法。實體瘤生長的骨髓瘤細(xì)胞接種需要提前10d進(jìn)行，體外培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞也需提前若干天使擴(kuò)大培養(yǎng)到107數(shù)量，要求細(xì)胞處于對數(shù)生長中晚期。所需骨髓瘤細(xì)胞可在融合前2h收集。

3．飼養(yǎng)細(xì)胞準(zhǔn)備

在鼠源雜交瘤技術(shù)中，往往需要制備飼養(yǎng)細(xì)胞。一般取自健康小鼠腹腔，主要屬于腹腔巨噬細(xì)胞。在融合前1h收集，用含血清培養(yǎng)液制備成2 104／m1密度的單細(xì)胞懸液。

在融合后的細(xì)胞培養(yǎng)過程中，起到飼養(yǎng)層細(xì)胞的作用。因為，融合后培養(yǎng)孔內(nèi)的參與融合過程但未形成脾細(xì)胞一骨髓瘤細(xì)胞雜交的細(xì)胞，如脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、脾細(xì)胞一脾細(xì)胞雜交細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞一骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞等，都會在HAT選擇培養(yǎng)液的培養(yǎng)環(huán)境中死亡．而存活的脾細(xì)胞一骨髓瘤細(xì)胞雜交細(xì)胞密度過低不利生存，需要飼養(yǎng)層細(xì)胞增加總體活細(xì)胞密度并吞噬死亡細(xì)胞碎片。

(二)細(xì)胞融合

細(xì)胞融合是指2個或2個以上的細(xì)胞，順序地發(fā)生了細(xì)胞膜融合、細(xì)胞質(zhì)融合和細(xì)胞棱融合等過程，然后這2個或2個以上的細(xì)胞形成1個融合細(xì)胞。即具有1套細(xì)胞膜、細(xì)胞匪和細(xì)胞核。

一般而言，遺傳穩(wěn)定的融合細(xì)胞僅可能來源于2個細(xì)胞之間的融合，往往保留了其中：種來源細(xì)胞的絕大多數(shù)基因組基因和另1種來源細(xì)胞的少量基因組基因，還需要及時地通過合適的分離純化手段如克隆化培養(yǎng)來篩選，因此，2個細(xì)胞之間的融合并不一定能形成遺傳穩(wěn)定的新細(xì)胞。至于3個或3個以上的不同種類細(xì)胞，也有可能通過細(xì)胞融合形成1十I臨時的融合細(xì)胞，但很難存活，不會形成遺傳穩(wěn)定的新細(xì)胞。綜合以上因素，在融合操作中-2種細(xì)胞的比例就顯得非常重要，如鼠源雜交瘤技術(shù)中，為了獲得高的融合效率，免疫后的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞一般按6：1的數(shù)量比例混合后再進(jìn)行融合操作。

細(xì)胞融合方法一般有病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合、PEG；介導(dǎo)細(xì)胞融合及電融合等。病毒介導(dǎo)的細(xì)胞融合方法要涉及仙臺病毒的培養(yǎng)和滅活，尤其是仙臺病毒的培養(yǎng)條件要求嚴(yán)格，過程比較復(fù)雜，因此現(xiàn)在一般不使用此方法。電融合為20世紀(jì)80年代興起的一種融合方法，需要特定的技術(shù)條件，如需要融合儀、融合池、融合緩沖液等，通過試驗探索zui佳的細(xì)胞排隊電壓、脈沖方波時程大小和脈沖間隔等融合參數(shù)才能順利進(jìn)行。目前廣泛使用的融合方法還是PEG融合法，該方法操作簡便、快速省時．有較好的融合效果。

(三)雜交瘤細(xì)胞的篩選

脾臟是動物體內(nèi)B淋巴細(xì)胞集中的zui大免疫器官，取出脾細(xì)胞(主要是B淋巴細(xì)胞)和骨髓瘤細(xì)胞融合后，能產(chǎn)生5種混合細(xì)胞類型：未融合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，自身融合的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，以及脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合形成的雜交瘤細(xì)胞。

在細(xì)胞融合后，要從上述5種細(xì)胞中篩選出雜交瘤細(xì)胞，一般使用HAT選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。

HAT培養(yǎng)基中含有次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。細(xì)胞的DNA合成有內(nèi)源性途徑(主要途徑)和外源性途徑(旁路途徑)兩種方式。內(nèi)源性途徑利用谷氨酰胺或單磷酸尿苷酸在二氫葉酸還原酶催化下合成DNA，外源性途徑則是利用次黃嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(TK)的催化下補(bǔ)救合成DNA，HAT培養(yǎng)基中氨基蝶呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑，能有效地阻斷DNA合成的內(nèi)源性途徑。B淋巴細(xì)胞具有HGPRT、TK這兩種酶，因此在內(nèi)源性途徑被阻斷后仍能利用HAT培養(yǎng)基中的次黃嘌呤和胸腺嘧啶來合成DNA，可在HAT培養(yǎng)基中存活．

但B淋巴細(xì)胞是正常細(xì)胞，故不能長期存活。鼠源雜交瘤技術(shù)中使用的SP2／0細(xì)胞為HGPRT的TK缺陷型，缺乏HGPRT酶和TK酶，在內(nèi)源性途徑被阻斷后不能進(jìn)行D_＼A的外源性合成，故不能在HAT培養(yǎng)基中存活。雜交瘤細(xì)胞由于繼承了B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雙重特性，能夠合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT選擇培養(yǎng)基中能存活.

因此，將融合后的混合細(xì)胞在HAT選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2周后，只有雜交瘤細(xì)胞能存活下來。

(四)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞檢測

存活下來的雜交瘤細(xì)胞不一定分泌抗體，因此，選擇并構(gòu)建合適的檢測方法用于及時、快速、準(zhǔn)確地檢測細(xì)胞克隆生長孔內(nèi)的雜交瘤細(xì)胞是雜交瘤技術(shù)的關(guān)鍵技術(shù)之一。所構(gòu)建的抗體檢測方法還能滿足在短時間內(nèi)檢測大量樣品的需求。

常用的方法有ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)、間接免疫熒光法和雙相擴(kuò)散法等，其中，ELISAzui常見。
一般是在單細(xì)胞克隆長滿100 顯微視場時進(jìn)行分泌抗體檢測。有抗體分泌的孔稱陽性孔，單細(xì)胞克隆孔或單克隆孔的細(xì)胞克隆稱為陽性克隆，所分泌的抗體即稱為單克隆抗體。

(五)分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)

對陽性孔中的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化培養(yǎng)的方法包括有限稀釋法、軟瓊脂平板法和顯微操作法等．以前者zui常見。

為了建立能穩(wěn)定分泌異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，往往需要進(jìn)行多次克隆化培養(yǎng)，直至所有單克隆孔的抗體表達(dá)量穩(wěn)定、一致時．便建立了一種雜交瘤細(xì)胞株。

(六)細(xì)胞株凍存及其他

遺傳穩(wěn)定的分泌異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，可進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)．然后命名、凍存。

雜交瘤細(xì)胞株的建立，是為了獲得持續(xù)分泌單克隆抗體的細(xì)胞株，以便制備各種用途的單克隆抗體。因此，需要對所分泌抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)性分析和Ig類型分析，為以后應(yīng)用該抗體提供必要的技術(shù)參數(shù)。單克隆抗體的免疫反應(yīng)性是指該抗體與其他抗體在與抗原反應(yīng)時是否存在交叉反應(yīng)，提示與其他抗體識別的抗原位點是否一致或相近。單克隆抗體的lg類型分析是檢測所分泌抗體的重鏈類型．如IgG、IgM或其他類型。

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