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DNA測(cè)序方法中自動(dòng)測(cè)序法的操作步驟
基因分析儀(即DNA測(cè)序儀)，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過(guò)單引物PCR測(cè)序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個(gè)堿基的3 末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測(cè)序PCR產(chǎn)物可在一根毛細(xì)管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測(cè)序的精確度。由于分子大小不同，在毛細(xì)管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過(guò)毛細(xì)管讀數(shù)窗口段時(shí)，激光檢測(cè)器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機(jī)檢測(cè)器就可對(duì)熒光分子逐個(gè)進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機(jī)上同步成像，分析軟件可自動(dòng)將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達(dá)到DNA測(cè)序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺(tái)能自動(dòng)灌膠、自動(dòng)進(jìn)樣、自動(dòng)數(shù)據(jù)收集分析等全自動(dòng)電腦控制的測(cè)定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測(cè)序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆?？讖骄唬苊饬伺淠z條件不一致對(duì)測(cè)序精度的影響。它主要由毛細(xì)管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機(jī)和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運(yùn)行等軟件。它使用最新的CCD攝影機(jī)檢測(cè)器，使DNA測(cè)序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由于該儀器具有DNA測(cè)序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測(cè)序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長(zhǎng)片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測(cè)序外，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測(cè)、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
一、準(zhǔn)備工作
1. BigDye測(cè)序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。
2. pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對(duì)照模板 0.2 g/L，試劑盒配套試劑。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 mol/L，即3.2 pmol/ l，試劑盒配套試劑。
4. DNA測(cè)序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1 l為宜。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/ l。
5. 引物需根據(jù)所要測(cè)定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物，配制成3.2 mol/L，即3.2 pmol/ l。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 滅菌去離子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 蓋體分離。
8. 3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8 g NaAc 3H2O溶于70 ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌后分裝。
9. 70%乙醇和無(wú)水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml無(wú)水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11. POP 6測(cè)序膠 。
12. 模板抑制試劑(TSR) 。
13. 10 電泳緩沖液 。
14. 全自動(dòng)DNA測(cè)序儀。
15. PCR儀。
16. 臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)。
17. 臺(tái)式高速離心機(jī)或袖珍離心機(jī)。
二、PCR測(cè)序反應(yīng)
1. 取0.2 ml的PCR管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測(cè)定模板管 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管
BigDye Mix 1 l 1 l
待測(cè)的質(zhì)粒DNA 1 l －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1 l
待測(cè)DNA的正向引物 1 l －
M13(-21)引物 － 1 l
滅菌去離子水 2 l 2 l
總反應(yīng)體積5 l，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
2. 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。98℃變性2 min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。
三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
1. 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 l醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 l洗滌沉淀2次。12 000 r/min于4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
四、電泳前測(cè)序PCR產(chǎn)物的處理
1. 加入12 l的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
2. 將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。
3. 在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機(jī)。
五、上機(jī)操作
1. 按儀器操作說(shuō)明書(shū)安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立運(yùn)行的測(cè)序順序文件。
2. 儀器將自動(dòng)灌膠至毛細(xì)管，1.2 kV預(yù)電泳5 min，按編程次序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。
3. 電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。
4. 每一個(gè)樣品電泳總時(shí)間為2.5 h。
5. 電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)分析或打印出彩色測(cè)序圖譜。
六、序列分析
儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序序列已知，可通過(guò)序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。
七、儀器清洗
測(cè)序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。
八、計(jì)算
1. 測(cè)序反應(yīng)精確度計(jì)算公式：100%－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650 100%。
2. 差異堿基即測(cè)定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。
歡迎訪問(wèn)中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng)，本站隸屬于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司，單位現(xiàn)提供微生物菌種及其細(xì)胞等相關(guān)產(chǎn)品查詢、咨詢、訂購(gòu)、售后服務(wù)！與國(guó)內(nèi)外多家研制單位，生物醫(yī)藥，第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)，科研院所有著良好穩(wěn)定的長(zhǎng)期合作關(guān)系！
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由于該儀器具有DNA測(cè)序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進(jìn)行DNA測(cè)序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長(zhǎng)片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進(jìn)行常規(guī)DNA測(cè)序外，還可進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測(cè)、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個(gè)體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
一、準(zhǔn)備工作
1. BigDye測(cè)序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。
2. pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對(duì)照模板 0.2 g/L，試劑盒配套試劑。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 mol/L，即3.2 pmol/ l，試劑盒配套試劑。
4. DNA測(cè)序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時(shí)取量1 l為宜。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/ l。
5. 引物需根據(jù)所要測(cè)定的DNA片段設(shè)計(jì)正向或反向引物，配制成3.2 mol/L，即3.2 pmol/ l。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 滅菌去離子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 蓋體分離。
8. 3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8 g NaAc 3H2O溶于70 ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌后分裝。
9. 70%乙醇和無(wú)水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml無(wú)水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11. POP 6測(cè)序膠 。
12. 模板抑制試劑(TSR) 。
13. 10 電泳緩沖液 。
14. 全自動(dòng)DNA測(cè)序儀。
15. PCR儀。
16. 臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)。
17. 臺(tái)式高速離心機(jī)或袖珍離心機(jī)。
二、PCR測(cè)序反應(yīng)
1. 取0.2 ml的PCR管，用記號(hào)筆編號(hào)，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測(cè)定模板管 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管
BigDye Mix 1 l 1 l
待測(cè)的質(zhì)粒DNA 1 l －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1 l
待測(cè)DNA的正向引物 1 l －
M13(-21)引物 － 1 l
滅菌去離子水 2 l 2 l
總反應(yīng)體積5 l，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
2. 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。98℃變性2 min后進(jìn)行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。
三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
1. 將混合物離心，將擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 l醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 l洗滌沉淀2次。12 000 r/min于4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
四、電泳前測(cè)序PCR產(chǎn)物的處理
1. 加入12 l的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
2. 將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。
3. 在PCR儀上進(jìn)行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機(jī)。
五、上機(jī)操作
1. 按儀器操作說(shuō)明書(shū)安裝毛細(xì)管，進(jìn)行毛細(xì)管位置的校正，人工手動(dòng)灌膠和建立運(yùn)行的測(cè)序順序文件。
2. 儀器將自動(dòng)灌膠至毛細(xì)管，1.2 kV預(yù)電泳5 min，按編程次序自動(dòng)進(jìn)樣，再預(yù)電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。
3. 電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)清洗，灌膠，進(jìn)下一樣品，預(yù)電泳和電泳。
4. 每一個(gè)樣品電泳總時(shí)間為2.5 h。
5. 電泳結(jié)束后儀器會(huì)自動(dòng)分析或打印出彩色測(cè)序圖譜。
六、序列分析
儀器將自動(dòng)進(jìn)行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進(jìn)行序列比較。如測(cè)序序列已知，可通過(guò)序列比較以星號(hào)標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。
七、儀器清洗
測(cè)序完畢按儀器操作規(guī)程進(jìn)行儀器清洗與保養(yǎng)。
八、計(jì)算
1. 測(cè)序反應(yīng)精確度計(jì)算公式：100%－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650 100%。
2. 差異堿基即測(cè)定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。
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