第二屆電鏡網(wǎng)絡(luò)會(huì)議(iCEM 2016)特邀報(bào)告

高壓快速冷凍電鏡固定技術(shù)及在生命科學(xué)中的應(yīng)用

趙善廷 教授

西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院

報(bào)告摘要：

　　電鏡技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用已有六十多年的歷史，為生命科學(xué)在形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的研究帶來(lái)了一場(chǎng)革命，突觸(synapse)的發(fā)現(xiàn)就是一個(gè)典型的例子，它結(jié)束了自十九世紀(jì)末至二十世紀(jì)五十年代近半個(gè)世紀(jì)有關(guān)神經(jīng)元之間是否有直接聯(lián)系的神經(jīng)生物學(xué)世紀(jì)之爭(zhēng)。

　　生命科學(xué)常規(guī)電鏡技術(shù)需要先用甲醛、戊二醛等化學(xué)試劑對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)固定，但化學(xué)固定有以下三個(gè)方面的缺點(diǎn)，一是固定過(guò)程至少需要數(shù)分鐘，而機(jī)體內(nèi)的許多生理過(guò)程都非常短暫，僅持續(xù)數(shù)秒甚至毫秒，如神經(jīng)元突觸小泡內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，用傳統(tǒng)化學(xué)固定方法無(wú)法撲捉到這些生理過(guò)程的形態(tài)學(xué)變化和特征，而且植物細(xì)胞有細(xì)胞壁，昆蟲(chóng)如線蟲(chóng)等體表有幾丁質(zhì)，化學(xué)固定劑很難滲透，嚴(yán)重影響固定的效果;二是包埋前需要用酒精等有機(jī)溶劑對(duì)樣品進(jìn)行脫水，這一過(guò)程會(huì)造成細(xì)胞和組織皺縮，使其形態(tài)和大小發(fā)生改變;三是化學(xué)固定劑特別是戊二醛可引起蛋白質(zhì)變性，造成蛋白質(zhì)抗原特性改變，使其與相應(yīng)抗體的結(jié)合能力下降甚至喪失，導(dǎo)致電鏡免疫組化染色失敗。

　　為克服化學(xué)固定以上缺點(diǎn)，科學(xué)家發(fā)明了一種新的物理性電鏡固定技術(shù)，稱(chēng)為高壓快速冷凍電鏡固定技術(shù)，利用該技術(shù)可以在不使用任何化學(xué)固定劑的條件下在五十毫秒之內(nèi)將組織和細(xì)胞完全固定，然后既可通過(guò)常規(guī)電鏡包埋和超薄切片后進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察和研究，也可通過(guò)冰凍替代技術(shù)包埋和切片后進(jìn)行包埋后免疫膠體金染色(post-labeling)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)下的定位定量研究。

　　雖然高壓快速冷凍固定技術(shù)克服了化學(xué)固定的三大缺點(diǎn)，但它本身也有一個(gè)缺點(diǎn)，即固定的樣品非常小，直徑不能超過(guò)1毫米，厚度不能超過(guò)200微米，限制了它在神經(jīng)生物學(xué)研究中的應(yīng)用。為了克服高壓冷凍固定技術(shù)的缺點(diǎn)，將其應(yīng)用到神經(jīng)生物學(xué)研究中，趙善廷教授與該技術(shù)的發(fā)明者Studer博士合作，將器官型腦片培養(yǎng)技術(shù)(organotypic slice culture)和高壓快速冷凍固定技術(shù)相結(jié)合，成功地研究了與學(xué)習(xí)和記憶密切有關(guān)的長(zhǎng)時(shí)程效應(yīng)(long-term potentiation, LTP)對(duì)突觸的影響。

　　結(jié)果顯示與化學(xué)固定相比高壓冷凍固定后細(xì)胞和組織的超微結(jié)構(gòu)更加清晰完整，LTP十分鐘后突觸小泡的數(shù)量明顯下降，突觸結(jié)構(gòu)明顯改變。結(jié)合包埋后免疫膠體金技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)高壓冷凍固定可明顯提高膠體金標(biāo)記的陽(yáng)性率和特異性。因此，高壓快速冷凍電鏡技術(shù)為研究突觸小泡遞質(zhì)釋放和再循環(huán)機(jī)制及相關(guān)蛋白在突觸上的超微結(jié)構(gòu)定位和定量等神經(jīng)生物學(xué)方面的研究提供了有利條件。

　　參考文獻(xiàn)：

　　1， Studer D*, Zhao S*(equally contributed), Chai X, Jonas Peter, Graber W , Nestel S, Frotscher M. Capture of activity-induced ultrastructural changes at synapses by high-pressure freezing of brain tissue. Nature Protocols. 2014;9(6):1480-95.

　　2，Zhao S, Studer D, Chai X, Graber W, Brose N, Nestel S, Young C, Rodriguez EP, Saetzler K, Frotscher M. Structural plasticity of hippocampal mossy fiber synapses as revealed by high-pressure freezing. J Comp Neurol. 2012;520(11):2340-5.

報(bào)告人簡(jiǎn)介：

　　趙善廷，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院“后稷學(xué)者”特聘教授，博士生導(dǎo)師，陜西省“百人計(jì)劃”入選者，德國(guó)漢堡大學(xué)客座研究員。

　　主要學(xué)習(xí)經(jīng)歷

　　1980.9-1985.7： 濱州醫(yī)學(xué)院，臨床醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè)，獲學(xué)士學(xué)位

　　1985.9-1988.7： 新疆醫(yī)科大學(xué)，組織胚胎學(xué)專(zhuān)業(yè)，獲碩士學(xué)位

　　1998.10-2001.1：德國(guó)Freiburg大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 解剖研究所，獲醫(yī)學(xué)博士學(xué)位

　　2001.1-2004.9： 德國(guó)Freiburg大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 解剖研究所，博士后

　　主要工作經(jīng)歷

　　1988.8-1998.9： 新疆醫(yī)科大學(xué)，組織胚胎學(xué)教研室，助教，講師，副教授

　　1997.5-1998.4： 德國(guó)Freiburg大學(xué)醫(yī)學(xué)院，解剖研究所，訪問(wèn)學(xué)者

　　2004.10-2010.12：德國(guó)Freiburg大學(xué)醫(yī)學(xué)院，解剖研究所，助理教授

　　2008.12-2011.3：蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，“萃英學(xué)者”特聘教授，博士生導(dǎo)師

　　2011.1-至今：西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院“后稷學(xué)者”特聘教授，博導(dǎo)，

　　陜西省“百人計(jì)劃”入選者，德國(guó)漢堡大學(xué)客座研究員

　　工作簡(jiǎn)介

　　在德國(guó)Freiburg大學(xué)醫(yī)學(xué)院，趙善廷主要以子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染、器官型腦片培養(yǎng)、熒光免疫組化、電鏡、激光共聚焦顯微鏡等形態(tài)學(xué)技術(shù)和原位雜交、Western-blot等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)大腦發(fā)育，成體神經(jīng)干細(xì)胞及突觸可塑性與學(xué)習(xí)和記憶的機(jī)制等神經(jīng)生物學(xué)熱點(diǎn)問(wèn)題進(jìn)行了深入和細(xì)致的研究。

　　回國(guó)后，在繼續(xù)進(jìn)行以上研究方向的基礎(chǔ)上，趙善廷開(kāi)展了環(huán)境和疫病對(duì)動(dòng)物和家畜神經(jīng)系統(tǒng)的影響、應(yīng)激和動(dòng)物福利對(duì)畜禽免疫力和健康養(yǎng)殖的影響及與食品安全的關(guān)系、中藥對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響及對(duì)老年性疾病的預(yù)防和治療等方面的研究。先后發(fā)表學(xué)術(shù)論文90余篇，其中在“Nature”子刊、“Journal of Neuroscience”、“Development”等國(guó)際著名學(xué)術(shù)雜志上發(fā)表SCI論文53篇，累積影響因子超過(guò)250，其中17篇影響因子在5以上，一篇影響因子高達(dá)31.7 。

　　自2002年以來(lái)作為主要人員參與德國(guó)及歐共體重大科研項(xiàng)目4項(xiàng)(相當(dāng)于中國(guó)973項(xiàng)目)，并主持一項(xiàng)子課題?；貒?guó)后主持2項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目和2項(xiàng)省部級(jí)項(xiàng)目。

報(bào)告時(shí)間：2016年10月26日上午