顯微鏡下金葡菌基因組DNA提取的技巧
一、組織抽提：

1. 顯微鏡下取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末
2. 移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打
3. 移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿
4. 冰上孵育5分鐘
5. 離心12,000g 4℃ 5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管
6. 加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘
7. 離心 12,000g 4℃ 10分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管
8. 加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘
9. 離心 12,000g 4℃ 5分鐘 棄去上清液
10. 加入1 ml 75%乙醇，震蕩
11. 離心 7,500g 4℃ 5分鐘 棄去上清液
12. 室溫下使之變透明
13. 加入DEPC處理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低溫冰箱）
14. 走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計(jì)檢測260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度

二、RT反應(yīng)體系（第一步）：約20分鐘
RNA 抽提物
5μl
Radome 引物
2μl
RNA sin
0.5μl

1. 65℃ 15分鐘
2. 立即放入冰浴
RT反應(yīng)體系（第二步）：約2小時(shí)
RNA sin
0.5μl
10mM dNTP
1μl
5×RT 緩沖液
4μl
25mM MgCl2
4μl
AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶
3μl

1. 37℃ 1.5小時(shí)
2. 94℃ 5-10分鐘

3. 反應(yīng)物保存于-20℃或進(jìn)行PCR

三1、PCR反應(yīng)體系：約4.5小時(shí)

25mM MgCl2
2μl

10×PCR 緩沖液
5μl

10mM dNTP
1μl

上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2

CDNA模板
2.5μl

ddH2O
34μl

Taq酶
0.5μl

輕質(zhì)石蠟油
50μl

100μl

1. 94℃ 2分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘 為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán)

2. 94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分鐘 為第二步30個(gè)循環(huán)

3. 72℃ 10分鐘

4. 取出后4℃ 5分鐘后-20℃保存或走電泳

三2、PCR反應(yīng)體系：約5小時(shí)

25mM MgCl2
3μl

10×PCR 緩沖液
5μl

10mM dNTP
1μl

上下游引物10pmol/μl
2.5μl×2

CDNA模板
5μl

ddH2O
30μl

Taq酶
1μl

輕質(zhì)石蠟油
50μl

100μl

1. 94℃ 2分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘 為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán)

2. 94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分鐘 為第二步40個(gè)循環(huán)

3. 72℃ 10分鐘

4. 取出后4℃ 5分鐘后-20℃保存或走電泳

四、電泳：約1.25小時(shí)

1. 配0.5×TBE電泳緩沖液300 ml

2. 膠濃度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g膠）

3. 微波爐中火2分鐘溶解膠

4. 冷卻至60℃加入溴乙錠2μl（10mg/ml的終濃度0.5μg/ml）

5. 放入梳子，澆板，待凝固

6. 加8μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物+2μl溴酚蘭

7. 電泳50-80V（每㎝ 5V）

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