前言：傳統(tǒng)中藥以口服用藥為主，其化學(xué)成分受胃腸道酸堿性、腸道微生 物及代謝酶等影響常發(fā)生轉(zhuǎn)化，使其生物利用度降低，體內(nèi)除中藥 原形成分外，還可能有大量代謝產(chǎn)物的存在，這些體內(nèi)吸收化學(xué) 成分是闡明中藥發(fā)揮藥效機(jī)制的直接物質(zhì)基礎(chǔ)。要想揭示中藥體內(nèi) 藥效物質(zhì)，代謝產(chǎn)物研究是不可缺少的重要組成部分，尤其是苷類 及其他結(jié)構(gòu)易轉(zhuǎn)化的化學(xué)成分（如萜類等），其生物利用度較低， 在體內(nèi)主要以代謝產(chǎn)物的形式存在，在此種情況下，代謝產(chǎn)物可能 是藥效的主要來(lái)源[1]。然而，由于中藥成分的代謝規(guī)律不明 確、代謝產(chǎn)物含量低難以鑒定等原因，大大制約了中藥體內(nèi)藥效物 質(zhì)基礎(chǔ)的研究。 

為了更加深入的研究中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，需要利用高分辨質(zhì)譜 對(duì)中藥體內(nèi)代謝物進(jìn)行更深度的鑒定分析。然而由于中藥體內(nèi)的代 謝物通常含量很低，且同時(shí)受到基質(zhì)背景的干擾，傳統(tǒng)LC Q-TOF MS高分辨質(zhì)譜的DDA數(shù)據(jù)采集模式難以獲得低含量代謝物的二級(jí) 質(zhì)譜圖用于結(jié)構(gòu)鑒定。新一代賽默飛Orbitrap ID-X Tribrid三合一質(zhì)譜儀由 于具有Acquire X智能化數(shù)據(jù)采集模式，自動(dòng)迭代生成排除列表及 包含列表，可以獲得極低含量組分的多級(jí)質(zhì)譜用于代謝物的深度分 析。

柴胡Bupleuri Radix為傘形科植物柴胡（又稱北柴胡）Bulpeurum chinese DC. 和狹葉柴胡（又稱南柴胡）Bulpeurum scorzonerifolium Willd的干燥根，其性味苦涼、微寒，具有解表和里、疏肝解 郁、升舉陽(yáng)氣之功效[2]。柴胡化學(xué)成分復(fù)雜，其中皂苷類、揮發(fā)油 類、黃酮類為柴胡的主要活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)、抗抑郁、保 肝、抗腫瘤、解熱抗炎等藥理作用[3-5]。近年來(lái)，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián) 用技術(shù)（LC-MS）的成熟與發(fā)展已被應(yīng)用于柴胡皂苷類組分的代謝研究[6,7]。然而，單個(gè)活性組分的代謝研究以及部分代謝物的鑒定結(jié) 果仍然無(wú)法全面綜合的評(píng)價(jià)柴胡的質(zhì)量和體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用離體實(shí)驗(yàn)的代謝研究方法，通過(guò)具有AcquireX采集功能 的Orbitrap ID-X Tribrid MS技術(shù)對(duì)柴胡代謝產(chǎn)物進(jìn)行整體分析。首先 用富含腸內(nèi)菌的糞便懸浮液與柴胡提取物在厭氧條件下溫孵，利用 Compound Discoverer 3.0代謝物分析軟件對(duì)采集的高分辨質(zhì)譜數(shù) 據(jù)進(jìn)行解析，最終構(gòu)建柴胡的腸內(nèi)菌代謝指紋圖，以期為中藥的臨 床合理應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)方法

1. 樣品前處理 取柴胡粉末約20g，加入150mL 70%乙醇置于圓底燒瓶中，加熱 回流提取60min，離心后取上清液，抽濾后濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 mL，凍干保存。腸內(nèi)菌液的收集與制備參考文獻(xiàn)[8]，培養(yǎng)時(shí)間分 別為0小時(shí)（對(duì)照組），1小時(shí)和24小時(shí)作為實(shí)驗(yàn)組樣品。用等量 的磷酸鉀緩沖溶液代替底物溶液，其它操作同實(shí)驗(yàn)組，此作為空白 組。

2. 色譜方法 超高效液相UHPLC（Dionex Ultimate 3000，Thermo Fisher Scientific）系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離，該系統(tǒng)由真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱 溫箱，和二元泵組成。色譜柱為Hypersil Gold C18（2.1 mm 100 mm，1.9 m，Thermo Fisher Scientic）；流動(dòng)相為0.1％甲酸水 （A）和乙腈100%（B）。流速為0.3mL / min，進(jìn)樣體積3uL， 柱溫40℃；采用梯度洗脫：起始，5%（B）；0-1min (5%-5％B); 1-5min (5%-50％B); 5-19min (50%-98％B); 19-23min (98%-98％B);23.1-25min (5% B)。

3. 質(zhì)譜條件 儀器：Thermo Scientic Orbitrap ID-X Tribrid 三合一質(zhì)譜儀，利用 AcquireX 智能數(shù)據(jù)采集模式獲得HR MS/MS， ESI 檢測(cè)模式，離子 源參數(shù)如下：Spray Voltage 3.5KV; Sheath Gas Pressure: 40arb; Aux Gas Pressure: 10arb; Capillary Temperature: 275℃; Heater Temperature: 350℃。質(zhì)譜掃描參數(shù)：掃描范圍 (Scan range)（m/z） ：120-1500；Full Mass分辨率(Orbitrap resolution)：120000，MS/ MS分辨率：30000；使用Xcalibur 4.1和 Compound Discoverer 3.0 化學(xué)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

1. Acquire X智能化數(shù)據(jù)采集模式 中藥代謝物由于其成分的高度復(fù)雜性，而且代謝物檢測(cè)容易受到基 質(zhì)的干擾，傳統(tǒng)的DDA模式很難采集到低含量代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖 進(jìn)行定性分析，Orbitrap ID-X中的Acquire X智能化數(shù)據(jù)采集模式可 以自動(dòng)生成排除列表及包含列表，特別適合于復(fù)雜樣品的深度分 析。AcquireX采集數(shù)據(jù)過(guò)程中，以溶劑作為空白對(duì)照，用于自動(dòng)生 成排除列表，排除背景離子；柴胡體外腸內(nèi)菌孵育樣品用于生成包 含列表。采集過(guò)程中將自動(dòng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)時(shí)更新采集方法。如 某一離子已經(jīng)觸發(fā)了MS/MS碎片，在下一針采集將自動(dòng)加入到排 除列表中，避免數(shù)據(jù)的冗余，節(jié)省出更多時(shí)間用于MS/MS離子的 觸發(fā)（如圖1所示）。

 2. 數(shù)據(jù)處理流程 數(shù)據(jù)處理采用Compound Discoverer (簡(jiǎn)稱CD)的工作流程Metabolism Expected w FISh and Unknown w MDF Pattern and Compound Class Scoring進(jìn)行代謝物的鑒定。實(shí)現(xiàn)自動(dòng)峰提取、空白扣除、分 子式生成，代謝物查找及鑒定等步驟。軟件中嵌入了常見(jiàn)的Ⅰ相代 謝和Ⅲ相代謝反應(yīng)，可以用于已經(jīng)代謝物的快速查找和鑒定工作。 此外上述工作流程還集合了MDF，F(xiàn)ISh Trace，和Pattern Trace 多 種算法，可以用于未知代謝物的查找和鑒定（如圖2）。在對(duì)代謝 物完成峰提取后，CD可以將代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖與母藥的二級(jí)質(zhì) 譜圖進(jìn)行鏡像比對(duì)，幫助進(jìn)行代謝位點(diǎn)確定。

3. Fragment Ion Search (FISh) 自動(dòng)輔助進(jìn)行代謝位點(diǎn)確認(rèn) 選擇柴胡中鑒定到的代表性物質(zhì)柴胡皂苷A和綠原酸為母藥，看這 些物質(zhì)在孵育基質(zhì)樣品中的代謝情況。下圖3a所示為柴胡皂苷A的 代謝物Dehydration+Dehydration+Stearyl Conjugation的二級(jí)質(zhì)譜 圖，綠色顏色標(biāo)記的碎片為代謝物和母藥相同的碎片，藍(lán)色顏色標(biāo) 記的碎片為代謝物的變化位點(diǎn)，由特征性碎片m/z 357.27844可知 此未知代謝物位點(diǎn)應(yīng)在葡糖糖上。下圖3b所示為綠原酸的代謝物 Dehydration+Dehydration+Acetylation的二級(jí)質(zhì)譜圖，由特征性碎 片m/z 169.01262可知此未知代謝物位點(diǎn)應(yīng)發(fā)生在奎尼酸上。

 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)采用Orbitrap ID-X Tribrid MS高分辨液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合 Compound Discoverer軟件中的代謝物分析工作流程，對(duì)中藥柴胡 體外腸內(nèi)菌代謝物進(jìn)行了快速準(zhǔn)確的分析。Compound Discoverer 內(nèi)置I 相+II相代謝途徑，針對(duì)已知和未知代謝物開(kāi)采用質(zhì)量虧損過(guò) 濾（MDF），碎片離子搜索策略（FISh），特征同位素，共有碎片 檢索等方式，尋找代謝物；同時(shí)軟件提供多種統(tǒng)計(jì)學(xué)工具，通過(guò)不 同給藥時(shí)間點(diǎn)或不同處理方式統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，確證代謝物。選擇柴胡 中鑒定到的代表性物質(zhì)柴胡皂苷A和綠原酸為母藥，在孵育基質(zhì)樣 品中柴胡皂苷A正離子模式共鑒定出14種可能的代謝物，負(fù)離子模 式鑒定出11種可能的代謝物；綠原酸共鑒定出5種可能的代謝物。

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