Rubp試劑盒；植物rubp羧化酶(Rubp)ELISA試劑盒

使用目的：

適用于檢測人動植物組織勻漿、細胞上清、血清、血漿、尿液或其他相關生物液體中濃度。

Rubp試劑盒；植物rubp羧化酶(Rubp)ELISA試劑盒檢測原理：

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被抗體的微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

Rubp試劑盒；植物rubp羧化酶(Rubp)ELISA試劑盒規(guī)格及配置：

名稱

96孔配置

48孔配置

微孔酶標板

12孔×8條

12孔×4條

標準品

0.3mL*6管

0.3mL*6管

樣本稀釋液

6mL

3mL

檢測抗體-HRP

10mL

5mL

20×洗滌緩沖液

25mL

15mL

底物A

6mL

3mL

底物B

6mL

3mL

終止液

6mL

3mL

封板膜

2張

2張

說明書

1份

1份

自封袋

1個

1個

  自備物品：

①.酶標儀（450nm）

②.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

③.37℃恒溫箱

Rubp試劑盒；植物rubp羧化酶(Rubp)ELISA試劑盒樣本的收集：

液體樣本的收集：

1、血清：用無菌管收集，室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

2、血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA、肝素鈉或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3、尿液：用無菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

4、胸腹水：用無菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5、腦脊液：用無菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

6、唾液：用無菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

7、細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

8、牛奶：用無菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

9、蜂蜜：用無菌管收集，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

10、全血：用含有抗凝劑的無菌管收集，立即輕輕搖動，來回輕輕顛倒數(shù)次，使血液和抗凝劑混勻，以防血液凝固。

固體樣本的收集 

1、組織標本：切割標本后，稱取 1g 組織，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清。分裝一 份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。對于植物組織，不好勻漿的話，就在液氮中充分研磨。

2、細胞內(nèi)蛋白樣本：許多待測蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細胞內(nèi)的蛋白，這個時候，要先收集細胞，洗滌干凈，再破碎細胞，離心取上清。

（1）培養(yǎng)的細胞

A、動物細胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融（如果反復凍融，破碎效果不好，就采用超聲波破碎），以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

B、植物細胞：用 PH7.2-7.4 的 PBS 稀釋細胞懸液，使細胞濃度達到 100 萬/ml 左右，置于冰盒上，用超聲破碎儀，設置破碎 2s，冷卻 30s 的方式，充分破碎細胞，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

（2）組織的細胞

切割標本后，稱取 1g 組織，加入 9ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），去除上清，再用 pH7.2-7.4左右的 PBS 小心洗滌沉淀的細胞三遍。再用上述的細胞破碎方法破碎細胞。

3、細胞內(nèi)蛋白樣本：許多待測蛋白不是分泌蛋白，而是存在于細胞內(nèi)的蛋白，這個時候，要先收集細胞，洗滌干凈，再破碎細胞，離心取上清。

4、咽拭子：加入 2ml 的 pH7.2-7.4 左右的 PBS，溶解咽拭子頭部，搖勻，用鑷子取出咽拭子并擠干液體，2-8℃條件離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分），仔細收集上清。分裝一份待檢測，其余冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。如果是測分泌蛋白，直接取上清檢測，測試細胞內(nèi)蛋白，要破碎細胞。

5、植物標本：取組織塊（0.2g～0.5g）最少可到 5～10mg 在冰冷的 PBS 中漂洗，濾紙拭干，準確稱重，放入 5ml 的勻漿管中；按重量(mg):體積(ml)=1:9 的比例加入 9 倍體積的勻漿介質(zhì)于勻漿管中，冰水浴條件下,用眼科小剪盡快剪碎組織塊；勻漿的方式：手工勻漿，機器勻漿。 ① 手工勻漿：左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉(zhuǎn)動研磨數(shù)十次（6～8 分鐘），充分研碎，制成 20%的勻漿液。 ② 機器勻漿：用組織搗碎機 10000～15000 轉(zhuǎn)/分 上下研磨制成 10%組織勻漿，也可用內(nèi)切式組織勻漿機制備（勻漿時間 10 秒/次，間隙 30 秒，連續(xù) 3～5 次，在冰水中進行,可適當延長勻漿時間），鏡檢觀察:取少量組織勻漿作涂片（直接涂片、染色均可以），顯微鏡下觀察細胞是否破碎，若沒有則可延長勻漿時間。將制備好的 10%勻漿液用普通離心機或低溫低速離心機 4000 轉(zhuǎn)/分左右,離心 10～15 分鐘，取上清液進行測定。

Rubp試劑盒；植物rubp羧化酶(Rubp)ELISA試劑盒操作步驟：

①．從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

②．設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

③．樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

④．除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

⑤．棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次  （也可用洗板機洗板）。

⑥．每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

⑦．每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。