一、 實驗儀器與試劑

表格一：實驗儀器

儀器

廠家

型號

細胞培養(yǎng)箱

Thermo Scientific

HERA cell CO2

低溫高速離心機

64R

BECKMAN  

流式細胞儀

BD

FACS Calibur

表格二：試劑

試劑

廠家

DMEM 培養(yǎng)液

Hyclone

PI

Sigma

PBS 7.4 (0.1 M)

自配

乙醇

國藥集團

RNA 酶

Sigma

二、 實驗步驟

細胞培養(yǎng) 取對數生長期的 A172 細胞，按 1*105個/mL 以 1mL 體積接種于 6 孔板內。無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)過夜,到轉染時使細胞達到 70％的匯合率。

轉染

將 12.5uL siRNA 溶于 387.5uL 無血清的 DMEM 中,混合均勻。

將 12.5uL Lipofectamine 2000 溶于 387.5uL 無血清的 DMEM 中，混合均

勻。在室溫下孵育 5 分鐘。

將上述兩種混合物混合（總體積 800uL）,輕輕混合均勻在室溫下孵育

20 分鐘形成復合物。

在 6 孔板中每孔加入 800uL 復合物。十字法混合均勻。

細胞在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6h 后棄上清液,并加入 10％胎牛血

清的 DMEM 培養(yǎng)液。

固定

培養(yǎng) 48h 后小心吸去上清，胰酶消化并離心收集細胞（1000rpm/min），棄上清，用預冷 PBS 洗細胞 2 次，加入預冷 70％乙醇， -20℃固定保存。

染色

離心，棄上清；

1mL PBS 洗 1 次，離心；

加入 10uL RNase A（20ug/mL）于 500uL PBS, 37 度 30min 孵育后，離心；

PBS 洗 1 次，離心；

加 10uL PI (50 ug/mL)于 500 uL PBS，室溫避光 30min。  

檢測

以標準程序用流式細胞儀檢測，汞激發(fā)波長 488nm，計數 1 萬個細胞，結果

使用 Modfit 軟件分析。

三、 實驗結果

省略

關注本網官方微信 隨時閱讀專業(yè)資訊