基因文庫：是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合?；蛭膸焓峭ㄟ^純化細(xì)胞總DNA，然后利用特定的限制性酶酶切產(chǎn)生能插入載體的片段，一般是 替換載體、粘?；蛘呤荵AC。

  對于植物、動物，所需要的克隆數(shù)很大，鑒定目的基因是一項艱巨的任務(wù)。對于這些生物體，可以使用細(xì)胞特異的cDNA文庫。cDNA文庫是將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，插入載體中構(gòu)建的文庫。

  每一個細(xì)胞都含有相同的基因，但不同細(xì)胞中有的基因是表達(dá)的， 而有的基因關(guān)閉。只有少量基因在所有的細(xì)胞類型中都表達(dá)，利用mRNA構(gòu)建的基因文庫，只含有表達(dá)的部分基因。例如麩朊（醇溶朊），小麥中的一種營養(yǎng)蛋白，在正發(fā)育的種子中，以非常高的水平表達(dá)，大約占總mRNA的30%。

  克隆的鑒定方法

  篩選目的克隆zui常用的方法是探針雜交法。

  探針是由目的基因的已知的信息決定的，有三種可能性：

  1） 目的基因在特定細(xì)胞中的豐度

  2） 基因所編碼的蛋白質(zhì)或者部分序列

  3） 基因是一個基因家族中的一個

  利用同源探針篩選目的克隆

  任意的兩條單鏈核酸分子都有可能通過堿基配對結(jié)合，大部分的配對分子是不穩(wěn)定的，因?yàn)橹挥猩倭康膲A基配對。然而如果兩條鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，大部分堿基可以配對形成穩(wěn)定的分子。不僅DNA間可以配對，DNA 與RNA間也可以進(jìn)行配對。因此可以使用同源探針篩選目的克隆。

  如果克隆的基因所編碼的蛋白已知。就可以利用遺傳密碼子預(yù)測相關(guān)基因的核苷酸序列，只有蛋氨酸和色氨酸無兼并密碼，其他的氨基酸至少有兩種密碼子。例如丙氨酸有四種密碼子，前兩位是相同的，GCA,GCT,GCC,GCG，只能正確的預(yù)測兩位的堿基。

  例如細(xì)胞色素C，從59號氨基酸的一段序列：Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met，相應(yīng)的DNA序列是TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG，在18個堿基中有14個是可以預(yù)測的。如果用來雜交的18核苷酸的序列有上千種可能的排列，很顯然不適合于合成探針。

  標(biāo)記探針的方法有：

  缺刻平移（Nick translation）

  末端填充法（end-filling）

  隨機(jī)引物法(詳細(xì)見影音文件)

  雜交后通過放射自顯影顯示出來。放射性對操作者有害，而且廢物對環(huán)境有污染，因此產(chǎn)生了一些新的方法。一種是生物素標(biāo)記法，利用利用抗生物素蛋白，可以產(chǎn)生熒光，這種方法與放射性的敏感度相同。另外一種方法是將DNA與山葵過氧化酶連接，通過酶的活性降解發(fā)光氨產(chǎn)生化學(xué)熒光，直接在普通的照相底片上顯示出來。

  菌落原位雜交

  雜交探針不僅可以鑒定細(xì)菌克隆也可以鑒定噬菌體形成的噬菌斑。

  首先將克隆或噬菌斑轉(zhuǎn)移到纖維素膜或尼龍膜上，去掉所有的殘留物，只留下DNA，這種處理同時導(dǎo)致了DNA變性，使雙鏈的氫鍵斷裂形成單鏈分子。通過80 C短時間處理，將DNA分子固定在膜上（纖維素膜）；對于尼龍膜需要進(jìn)行紫外交聯(lián)，通過糖-磷酸中樞將分子連接到膜上。

  標(biāo)記探針，加熱變性，加入到雜交膜上進(jìn)行雜交，然后洗去未結(jié)合的探針，干燥，接合探針的位置就可以檢測出來。

  利用mRNA的豐度篩選cDNA文庫

  形成中的種子的cDNA文庫中，相當(dāng)一部分克隆是gliadin基因。利用文庫中的所有單個cDNA克隆作為探針，隨機(jī)選取一個克隆，純化重組DNA分子，標(biāo)記成探針，與剩余的克隆進(jìn)行雜交，選取不同的克隆作探針，直到有一個探針能與文庫中的大部分克隆雜交，這種豐富的cDNA可能就是gliadin基因，然后進(jìn)一步分析，通過測序，表達(dá)產(chǎn)物分析驗(yàn)證。

  利用異源探針可以鑒定相關(guān)的基因

  不同生物控制同一蛋白的基因，有許多相同的序列，顯示了進(jìn)化中的保守性。利用相關(guān)基因的保守序列可以將不同生物中的基因克隆出來。例如酵母中細(xì)胞色素C探針可以將其他生物中的細(xì)胞色素C基因鑒定出來。當(dāng)然實(shí)驗(yàn)條件需要調(diào)整，主要是降低退火的溫度。

  異源探針還可以鑒定同一生物中相關(guān)的基因。

  利用抗體篩選cDNA表達(dá)文庫

  除了雜交探針外，還可以選擇免疫學(xué)篩選。雜交探針直接鑒定克隆的DNA片段，而免疫學(xué)方法鑒定的是克隆基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)。

  a) 抗體

  如果蛋白質(zhì)樣品注射進(jìn)兔子體內(nèi)，動物的免疫系統(tǒng)就會合成抗體結(jié)合、降解外來分子。在自然過程中，動物利用這種防御機(jī)制對付細(xì)菌、病毒和其他藥品的入侵。

  當(dāng)一種蛋白進(jìn)入兔子體內(nèi)，其血液中的抗體在隨后的幾天時間內(nèi)保持較高的濃度，可以獲得大量的純化的抗體。

  b) 利用純化的抗體檢測重組克隆中的蛋白

  重組克隆轉(zhuǎn)到聚乙烯膜上，裂解細(xì)胞，添加含有抗體的溶液，抗體本身是經(jīng)過標(biāo)記的，聚乙烯膜也要經(jīng)過含有標(biāo)記過的蛋白A溶液的沖洗，這樣細(xì)菌的蛋白就會特異的結(jié)合到利用抗體制備的免疫球蛋白上?？梢杂梅派湫詷?biāo)記也可以利用產(chǎn)生熒光或化學(xué)光的非放射性標(biāo)記。

  c) 基因表達(dá)的問題

  免疫檢測依賴于克隆基因的表達(dá)，然而一種生物的基因在不同的生物中可能不表達(dá)。特別是動物或植物（葉綠體除外）的基因在大腸桿菌中表達(dá)的可能性極小。

  可以利用特殊的載體，稱為表達(dá)載體來解決這一問題，表達(dá)載體是為在細(xì)菌細(xì)胞中啟動克隆的基因表達(dá)而設(shè)計的。將動物基因克隆到表達(dá)載體，然后重組到E. coli中進(jìn)行免疫篩選是非常有效的，已經(jīng)獲得了多個重要的激素基因。

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