通過(guò)細(xì)胞融合技術(shù)將B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，所產(chǎn)生的融合細(xì)胞既具有親本骨髓瘤細(xì)胞的無(wú)限繁殖的生物學(xué)特性，又具有另一親本B淋巴細(xì)胞合成、分泌特異性抗體的能力。應(yīng)用此技術(shù)從一個(gè)抗體分泌性B細(xì)胞雜交瘤分裂增殖，形成一個(gè)大的細(xì)胞克隆。由B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞克隆產(chǎn)生的只識(shí)別抗原分子上某一個(gè)抗原決定簇的純抗體，即單克隆抗體。單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、利于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化即可大量生產(chǎn)供應(yīng)等特點(diǎn)。

  在單克隆抗體制備中，雖然除小鼠外其它動(dòng)物也可用于制備雜交瘤，但本書(shū)以小鼠為例來(lái)說(shuō)明有關(guān)技術(shù)，同樣的技術(shù)也可用于大鼠骨髓瘤的融合及抗體篩選。對(duì)特殊動(dòng)物之間或與人細(xì)胞的融合，也有簡(jiǎn)要說(shuō)明。

單克隆抗體的制備是一個(gè)復(fù)雜、精細(xì)的工藝過(guò)程。為對(duì)全過(guò)程有一個(gè)概括的了解，先用表1 列出mAbs制備過(guò)程中的各個(gè)階段。一般將全過(guò)程分為三個(gè)階段：（1）免疫小鼠；（2）建立篩選方法和程序；及（3）雜交瘤生成。 

表1  雜交瘤細(xì)胞生成的各個(gè)階段和所需時(shí)間

動(dòng)物免

疫階段

初始免疫

兩周

一個(gè)月到一年

10天

強(qiáng)化免疫

血清測(cè)試

方法建

立階段

篩選方法的建立與測(cè)試

zui少

兩周

大約一個(gè)月

zui后一次強(qiáng)化免疫

三

天

雜交瘤細(xì)胞生成階段

大約

一周

細(xì)胞融合

大約一個(gè)月

篩選陽(yáng)性克隆

 陽(yáng)性克隆擴(kuò)增及凍存

大約

一周

單細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)

篩  選

部分陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)增*

大部?jī)龃妫ūＡ魖ui后所得的雜交瘤細(xì)胞）

 *得到擴(kuò)增的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞后，可從其培養(yǎng)液中收集含單克隆抗體的上清液，進(jìn)行鑒定（其抗體含量為10-50 g/ml）；

  *雜交瘤細(xì)胞也可進(jìn)行小鼠腹腔注射，以產(chǎn)生Mab含量高的腹水（其抗體含量為1-10mg/ml）。 

  以上每一階段都有可能迅速順利完成，但各階段也都有其本身的問(wèn)題，需在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前予以充分考慮，以免影響全局。以下分別進(jìn)行討論。動(dòng)物在注入抗原后，一旦出現(xiàn)良好的體液免疫應(yīng)答，同時(shí)又已建立合用的篩選方法，并通過(guò)血清對(duì)所建立篩選方法進(jìn)行評(píng)價(jià)、確定方法后，才可開(kāi)始雜交瘤細(xì)胞的制備。其過(guò)程大致為：在細(xì)胞融合前數(shù)日，用抗原免疫動(dòng)物；將從免疫動(dòng)物得到的分泌抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞相混，進(jìn)行細(xì)胞融合（有效的細(xì)胞融合約可得1/105存活的雜交細(xì)胞）；其后，將融合細(xì)胞用所選擇的培養(yǎng)基限定稀釋，置多孔培養(yǎng)板進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞融合后一周，即可對(duì)雜交瘤進(jìn)行測(cè)試，從陽(yáng)性培養(yǎng)孔所取的細(xì)胞先增殖，然后，進(jìn)行克隆化（即單克隆生長(zhǎng)），雜交瘤的生成與克隆需要時(shí)間，很少的實(shí)例只需要兩個(gè)月，有的甚至要一年時(shí)間。因制備mAbs 過(guò)程中的每一步都對(duì)其后各步影響很大，因此均需注意選擇zui適宜的條件，如：

1）要注意抗原的選擇及其性質(zhì)，如細(xì)胞、蛋白質(zhì)、半抗原等；

2）根據(jù)抗原得性質(zhì)和得量和對(duì)抗體得要求等，計(jì)劃及建立免疫的途徑和方式；

3）選定篩選的方法：抗體篩選的測(cè)試方法必須簡(jiǎn)單、可重復(fù)、特異，并可適用于mAb的zui終使用（即免疫熒光、免疫沉淀、功能試驗(yàn)等中的應(yīng)用）；

4）要確定細(xì)胞培養(yǎng)的條件；

5）進(jìn)行細(xì)胞融合的方式：包括雜交方法和細(xì)胞的選擇，和克隆的方式（限制性稀釋或軟膠法）等。

  典型的單克隆抗體的制備過(guò)程為：

1． *次對(duì)每一小鼠注射500 l抗原與完全福氏佐劑1：1的混和液（ip）。 共注6支BALB/c雌性小鼠（抗體的實(shí)際需用量見(jiàn)表2）；

2．14天后，再次注射，但改用抗原與不完全福氏佐劑混合液；

3．第24天，從免疫小鼠尾靜脈取血，血清經(jīng)PBS 1：5稀釋，以同樣稀釋的正常血清為對(duì)照，用點(diǎn)雜交（Dot blot）法進(jìn)行測(cè)定；

4．第35天，所有小鼠均經(jīng)腹腔再注射抗原與不完全福氏佐劑混合液；

5．第45天，取尾靜脈血，用點(diǎn)雜交法再次檢測(cè)。所有血清樣品均通過(guò)與在體同位素標(biāo)記的抗原進(jìn)行免疫沉淀法檢測(cè)；

6．第56天，對(duì)免疫應(yīng)答zui好的小鼠再靜脈注射100 l 及腹腔注視100 l不完全福氏佐劑抗原混合液，而對(duì)所有其余小鼠僅腹腔注射不完全福氏佐劑抗原混合液；

7．第59天由免疫應(yīng)答zui好的小鼠取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合；

8．第66天，開(kāi)始艱巨的工作，尋找*個(gè)陽(yáng)性克隆的篩選。

*具體免疫抗原用量參見(jiàn)表2。 

表2 抗原的參考用量

抗原類型

舉  例

初次免疫及加強(qiáng)免疫

zui后加強(qiáng)免疫

抗原的劑量與方式

抗原的劑量與方式

可溶性蛋白

酶、多肽與載體蛋白

復(fù)合物、免疫復(fù)合物

5-50 g,+佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，iv

顆粒性蛋白

已殺死的病毒或酵母

或細(xì)菌，結(jié)構(gòu)蛋白

5-50 g,+佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，iv

不溶性蛋白

細(xì)菌包含體的產(chǎn)物

與固相小球結(jié)合的

經(jīng)免疫純化蛋白

5-50 g,+佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，ip

活 細(xì) 胞

哺乳動(dòng)物細(xì)胞 

105-107 細(xì)胞 佐劑，ip

106 細(xì)胞, -佐劑，iv

活癌源細(xì)胞

哺乳動(dòng)物癌源細(xì)胞

104-106 細(xì)胞 佐劑，ip

106 細(xì)胞, -佐劑，iv

糖  類

多糖、糖蛋白

5-50 g,+/-佐劑，ip或sc

5-50 g, -佐劑，iv

核  酸

核酸與載體蛋白復(fù)合物

5-50 g,+佐劑，ip

5-50 g, -佐劑，iv

ip 腹腔注射； sc 皮下注射；iv 靜脈注射 

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