得不到陽性克??？可能是忽視了這些細(xì)節(jié)

過去，提起 分子克隆 或 載體構(gòu)建 這兩個(gè)詞，大家可能想到的是傳統(tǒng) 酶切酶連法 ，即用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生黏性末端，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，連接兩個(gè)片段的克隆方法。

近年來， 同源重組技術(shù) 逐漸受到科研人員的歡迎，如翊圣Hieff Clone 一步法快速克隆技術(shù)。相比之下，同源重組技術(shù)操作更加簡單，不受到酶切位點(diǎn)的限制，可一次進(jìn)行多個(gè)片段的拼接，大大的提高了克隆效率。

雖然同源重組技術(shù)操作簡單，但畢竟實(shí)驗(yàn)過程是環(huán)環(huán)相扣的，一旦某個(gè)細(xì)節(jié)處理不好，都可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。為此，小編精心整理了同源重組實(shí)驗(yàn)的常見問題，并給出了可能的原因和解決方案。希望新手們在遇到類似問題時(shí)可快速判斷可能的原因，節(jié)省時(shí)間，更順利的完成實(shí)驗(yàn)。

常見問題分類：

 無克隆。

 假陽性。

 菌落PCR無條帶。

 酶切鑒定多條帶。

無克隆

出現(xiàn)無克隆的現(xiàn)象，可能的原因主要是連接不成功或連接成功，但轉(zhuǎn)化失敗。具體原因分別如下：

1、 連接不成功。

可能原因

解決方法

1）引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤。

1）設(shè)計(jì)原則：同源臂（15-25 bp，GC含量40-60%）+酶切位點(diǎn)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求保留或刪除)+基因特異性引物。

2）判斷方法：可用翊圣無縫克隆引物設(shè)計(jì)軟件核對(duì)，鏈接：h、t、t、p :122.112.245.84:8080/hieff-clone/

2）載體與目的片段使用比例失調(diào)。

1）載體和目的片段濃度測定方法：常用吸光度法或瓊脂糖電泳法。

2）載體與目的片段添加比例：

①單片段建議：最適載體與目的片段摩爾比為1:2-1:3，載體使用量為0.03 pmol；目的片段使用量為0.06-0.09 pmol。

②多片段建議：最適DNA使用量為每片段（含線性化載體）0.03 pmol。

3）載體與目的片段不純。

1）推薦對(duì)線性化載體、PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。

2）純化產(chǎn)物建議溶解在pH8.0的ddH2O中保存。

3）若為未純化的DNA，加入總體積不超過反應(yīng)體系體積1/5。

4）操作問題或試劑盒失效。

建議做試劑盒附帶的陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。判斷方法：

1）若陽性對(duì)照有克隆并檢測為陽性，則排除試劑盒問題。

2）若陽性對(duì)照無克隆，可能是操作問題或試劑盒失效，建議換其他人或換試劑盒進(jìn)行陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定問題。

2、 連接成功，但無克隆。

可能原因

解決方法

1）感受態(tài)細(xì)胞效率低，＜107 cfu/ g。

建議用轉(zhuǎn)化效率大于107 cfu/ g的感受態(tài)細(xì)胞。

判斷方法：可轉(zhuǎn)化0.1ng質(zhì)粒（如PUC19），觀察克隆數(shù)，若生長大于1000個(gè)菌斑，則轉(zhuǎn)化效率大于107 cfu/ g。

2）抗生素種類錯(cuò)誤。

建議將未線性化載體轉(zhuǎn)化涂板。

判斷方法：若未長克隆，則可能是抗性種類錯(cuò)誤或濃度過高。需檢查質(zhì)粒圖譜確認(rèn)抗性或確認(rèn)最適濃度。

假陽性

出現(xiàn)假陽性的情況，主要表現(xiàn)有兩種，克隆不含插入片段或含有錯(cuò)誤的插入片段。具體原因分別如下：

1、克隆不含插入片段（空載）。

可能原因

解決方法

1）載體線性化不完全。

建議將已制備的線性化的載體轉(zhuǎn)化涂板。  

判斷方法：如果長克隆較多，則表示線性化不完全。建議優(yōu)化酶切體系。

2）體系中混入了相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒。

1）產(chǎn)生原因：

①以反向PCR方式進(jìn)行載體線性化，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板導(dǎo)致。

②目的基因PCR模板為與載體相同抗性的環(huán)狀質(zhì)粒，殘留環(huán)狀 質(zhì)粒模板導(dǎo)致。

2）判斷方法：將已制備的線性化載體和目的片段分別轉(zhuǎn)化涂板，如果長克隆較多，則表示有相同抗性的環(huán)狀質(zhì)?；烊搿＝ㄗhPCR擴(kuò)增產(chǎn)物先用DpnI 消化模板后，再進(jìn)行膠回收純化處理或直接進(jìn)行膠回收純化處理，去除殘留的環(huán)狀模板質(zhì)粒導(dǎo)致的假陽性。

2、克隆含有錯(cuò)誤的插入片段。

可能原因

解決方法

1）PCR產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。

1）可能情況：PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)有非特異條帶出現(xiàn)，未進(jìn)行膠回收純化。

2）解決方案：

①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；

②膠回收PCR產(chǎn)物；

③鑒定更多的克隆。

2）片段缺失。

1）可能情況：載體或片段有多個(gè)同源重復(fù)序列。

2）解決方案：借助網(wǎng)站或軟件進(jìn)行序列比對(duì)（如NCBI， Vector NTI等）。

菌落PCR無條帶

出現(xiàn)菌落PCR無條帶的現(xiàn)象，可能與PCR擴(kuò)增或重組連接有關(guān)，具體原因分別如下：

可能原因

解決方法

1）菌落PCR引物錯(cuò)誤。

建議用載體的通用引物進(jìn)行菌檢，或至少使用一條通用引物。

2）PCR體系或程序不合適。

1）可能情況：用目的片段引物和載體通用引物擴(kuò)增都無產(chǎn)物。

2）解決方案：

①優(yōu)化PCR體系、程序；

②提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；

③換酶切法鑒定克隆。

3）連接失敗。

1）判斷方法：目的引物或一端載體通用引物，另一端目的引物擴(kuò)增無條帶，但載體通用引物擴(kuò)增有條帶，且大小符合空載。

2）可能原因：載體線性化不完全。建議優(yōu)化酶切體系。

酶切鑒定多條帶

可能原因

解決方法

重組載體上有多個(gè)相同的酶切位點(diǎn)。

1）換其他酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切鑒定；

2）更換克隆鑒定方法，如換成菌落PCR或測序鑒定。

以上同源重組的常見問題您中槍過嗎？若有，快來 對(duì)號(hào)入座 吧。如果還有其它更多關(guān)于一步法快速克隆的問題，歡迎留言或來電。

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