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芽孢又叫內(nèi)生孢子，通常為圓形或橢圓形，是芽孢桿菌屬和梭菌屬生長到一定階段形成的一種抗逆性很強的體眠體結(jié)構(gòu)。芽孢染色可以用的染料很多,但是由于芽孢壁厚、透性低，所以著色、脫色均較困難。

芽孢染色原理

芽孢染色法是利用細菌的芽孢和菌體對染料的親合力不同的原理，用不同染料進行著色，使芽孢和菌體呈不同的顏色而便于區(qū)別。一般芽孢染色時會選用弱堿性染料，如：如孔雀綠（malachite green）或堿性品紅（basicfuchsin）在加熱條件下進行染色。染色時染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出，若再用復(fù)染液（如番紅液）或襯托溶液（如黑色素溶液）處理，則菌體和芽孢易于區(qū)分。常用的芽孢染色法是孔雀石綠染色法，芽孢被染上青綠色，而菌體被番紅復(fù)染為紅色。

芽孢染色方法

方法1

（1）將培養(yǎng)24小時左右的枯草芽孢桿菌或其他芽孢桿菌，作涂片、干燥、固定。

（2）滴加3 5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上。

（3）用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰，切忌使染液蒸干，必要時可添加少許染液。加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約4-5分鐘。這一步也可不加熱，改用飽和的孔雀綠水溶液（約7．6%）染10分鐘。

（4）傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止。

（5）用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗至水為無色。

（6）待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

注意事項

（1）選用適當(dāng)菌齡的菌種，幼齡菌尚未形成芽孢，而老齡菌芽孢囊已經(jīng)破裂。

（2）加熱染色時必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂，加熱不夠則芽孢難以著色。

方法2

（1）取二支潔凈的小試管，分別加入0．2ml無菌水，再往一管中加入1-2接種環(huán)的蠟狀芽孢桿菌的菌苔，另一管中加入1-2接種環(huán)的生孢梭菌的菌苔，兩管各自充分混合成濃厚的菌懸液。

（2）在菌懸液中分別加入0．2ml苯酚品溶液，充分混合后，于沸水浴中加熱3-5分鐘。

（3）用接種環(huán)分別取上述混合液2-3環(huán)于兩片載玻片上，涂薄，風(fēng)干后，將載玻片稍傾斜于燒杯上，用95%乙醇沖洗至無紅色液流出。

（4）再用自來水沖洗，濾紙吸干。

（5）取1 2接種環(huán)黑色素溶液于涂片處，立即展開涂薄，自然干燥后，油鏡觀察，在淡紫灰色背景的襯托下，菌體為白色，菌體內(nèi)的芽孢為紅色。

芽孢染色注意事項

1.為了防止細菌體和孢子體熱脹冷縮過于劇烈而發(fā)生形變從而影響兩者之間形狀區(qū)別的觀察，芽孢染色時需要進行加熱。

2.芽孢出現(xiàn)在微生物生長曲線的衰亡期,剛菌齡較小的菌是不會產(chǎn)生芽孢的.而菌齡較老的細菌容易失落鞭毛,所以芽孢染色用的菌種要控制菌齡。

鏡檢怎樣區(qū)分芽孢死活，用什么染色劑

要區(qū)別芽孢死活用一般染色劑難以做到，芽孢本來就是休眠體，你想想休眠的動物如蛇、青蛙、熊，你怎么區(qū)分他們是死是活？當(dāng)然是把他們放在合適的環(huán)境下，活的就會表現(xiàn)出活的跡象，比如呼吸、心跳...同理，在載玻片上芽孢區(qū)域滴上幾滴芽孢萌發(fā)劑，常見的有AGFK、L-丙氨酸、葡萄糖等，這個搜索到，查文獻亦可，置于30 培養(yǎng)箱30分鐘，然后鏡檢，能夠萌發(fā)成營養(yǎng)體的就是有活性的芽孢，反之就是死的（但不排除萌發(fā)受體缺失突變的芽孢，自然情況下是很少出現(xiàn)的，一般科學(xué)研究中才會人為篩選出）。

上海嵐興生物科技為生化試劑供應(yīng)商，專業(yè)生產(chǎn)銷售生化試劑、生物試劑、細胞培養(yǎng)、試劑盒、實驗耗材等產(chǎn)品。芽孢染色試劑盒利用芽胞具有高度的折光性，外膜致密，滲透性低，著色和脫色均較困難。在加熱條件下進行染色時，染料不僅進入菌體也可進入芽孢內(nèi)，進入菌體的染料可被酒精脫色，而芽胞上的染料仍保留，經(jīng)復(fù)染劑復(fù)染后，菌體和芽胞呈現(xiàn)出不同的顏色。

芽孢染色試劑盒使用步驟：

1、制作一適當(dāng)厚度的細菌涂片，自然干燥，通過火焰加熱固定。

2、滴加適量染色液 A 于涂片上，在酒精燈上加熱，使染液冒蒸汽但不沸騰。必要時可續(xù)加染液以免干涸。維持 4-5 分鐘。

3、待標(biāo)本冷卻后以 95%酒精脫色液沖洗至無紅色染液脫出為止，水洗。

4、滴加染色液 B 復(fù)染約 2-3 分鐘，水洗至無染液脫出為止。

5、待干后油鏡觀察。預(yù)期結(jié)果：菌體呈藍色，芽孢呈紅色。

注意事項：

1.供芽孢染色用的培養(yǎng)物應(yīng)控制菌齡，要求大部分芽孢仍保留在菌體內(nèi)為宜。

2.加熱染色時必須維持在染液冒蒸汽的狀態(tài)，加熱沸騰會導(dǎo)致菌體或芽孢囊破裂，加熱不夠則芽孢難以著色。

3.請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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