JC-1法檢測線粒體膜電位，以及檢測線粒體膜電位的操作步驟！

 

線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1 法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一種以 JC-1 為熒光探針，快速靈敏地檢測細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測，CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽性對照。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

 

產(chǎn)品組成：

 

編號

50T

100T

Storage

名稱

 

 

 

試劑(A): JC-1 Stain(200 )

3 100 l

5 100 l

-20℃ 避光

 

 

 

 

試劑(B): JC-1 Buffer(5 )

40ml

80ml

4℃

 

 

 

 

試劑(C): CCCP(10mM)

10 l

20 l

-20℃

 

 

 

 

試劑(D): ddH2O

45ml

90ml

RT

使用說明書

 

1 份

 

 

 

 

 

 

操作步驟(僅供參考)：

1、配制 JC-1 染色工作液：

 

取適量 JC-1 Stain (200 )，按照每 50 l JC-1 Stain (200 )加入 8ml ddH2O 的比例稀釋 JC-1，劇烈 Vortex 充分溶解并混勻 JC-1 Stain。然后再加入 2ml JC-1 Buffer(5 )，

混勻后即為 JC-1 染色工作液。6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量為 1ml，其它培養(yǎng)器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此類推；對于細(xì)胞懸液每 0.5～1.0 106 細(xì)胞需 0.5ml JC-1 染色工作液。

 

2、設(shè)置陽性對照：

推薦 CCCP(10mM)按照 1:1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，稀釋至 10 M，處理細(xì)胞20min。隨后按照下述方法裝載 JC-1，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測。對于大多數(shù)細(xì)胞，通常 10 M CCCP 處理 20min 后線粒體的膜電位會完全喪失，JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光；而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-1 染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對于特定的細(xì)胞，CCCP 的作用濃度和作用時間可能有所不同，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定。

 

3、對于懸浮細(xì)胞：

取 1～6 105 細(xì)胞，重懸于 0.5ml 細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

 

加入 0.5ml JC-1 染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min。

 

在孵育期間，按照每 1ml JC-1 Buffer(5 )加入 4ml 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 Buffer(1 )，并放置于冰浴。

 

37℃孵育結(jié)束后， 4℃ 600g 離心 3～4min，沉淀細(xì)胞。棄上清，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

 

用 JC-1 Buffer(1 )洗滌 2 次：加入 1ml JC-1 Buffer(1 )重懸細(xì)胞，4℃ 600g 離心3～4min，沉淀細(xì)胞，棄上清。再加入 1ml JC-1 Buffer(1 )重懸細(xì)胞，4℃ 600g 離心

3～4min，沉淀細(xì)胞，棄上清。

 

再用少量 JC-1 Buffer(1 )重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光分光光度計檢測或流式細(xì)胞儀分析。

JC-1法檢測線粒體膜電位，以及檢測線粒體膜電位的操作步驟！

4、對于貼壁細(xì)胞：

 

注意：對于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計或流式細(xì)胞儀檢測，應(yīng)先收集細(xì)胞，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測方法。

 

吸除 6 孔板培養(yǎng)液，根據(jù)具體實驗如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次，加入 1ml 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

 

加入 1ml JC-1 染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min。

 

在孵育期間，按照每 1ml JC-1 Buffer(5 )加入 4ml 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 Buffer(1 )，并放置于冰浴。

 

37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-1 Buffer(1 )洗滌 2 次。

 

加入 2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

 

熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。

 

5、對于純化的線粒體：

 

把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 Buffer(1 )稀釋 5 倍。

 

0.9ml JC-1 染色工作液中加入 0.1ml 總蛋白量為 10～100 g 純化的線粒體。

 

用熒光分光光度計或熒光酶標(biāo)儀檢測：混勻后直接用熒光分光光度計進(jìn)行時間掃描，激發(fā)波長為 485nm，發(fā)射波長為 590nm。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長不能設(shè)置為 485nm 時，可以在 475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長。另外，也可以參考下面步驟 6

 

 

中的波長設(shè)置進(jìn)行熒光檢測。 d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6。

 

6、熒光觀測和結(jié)果分析：

 

檢測 JC-1 單體時可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm，發(fā)射光設(shè)置為 530nm；檢測 JC-1 聚合物時，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm，發(fā)射光設(shè)置為 590nm。注意：此處測定熒光時不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在zui大激發(fā)波長和zui大發(fā)射波長。如使用熒光顯微鏡觀察，檢測 JC-1 單體時可以參考觀察其它綠色熒光時的設(shè)置，如觀察 GFP 或 FITC 時的設(shè)置；檢測 JC-1 聚合物時可以參考觀察其它紅色熒光，如碘化丙啶或 Cy3 時的設(shè)置。出現(xiàn)綠色熒光說明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說明線粒體膜電位比較正常，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常。

 

注意事項：

 

1、 JC-1 Stain(200 )應(yīng)完全溶解混勻后使用，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。必須先把 JC-1 用 ddH2O 充分溶解混勻后，才可加入 JC-1 Buffer(1 )。不可先配制 JC-1 Buffer(1 )再加入

 

JC-1 Stain(200 )，否則導(dǎo)致 JC-1 很難充分溶解，嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測。

 

2、 對于 6 孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測 100 個樣品；對于 12 孔中的樣品，本試劑盒共可以檢測 200 個樣品。

 

3、 裝載完 JC-1 后用 JC-1 Buffer(1 )洗滌時，盡量使 JC-1 Buffer(1 )保持 4℃左右，此時的洗滌效果較好。

 

4、 JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30min 內(nèi)完成后續(xù)檢測，在檢測前需冰浴保存。

 

5、 勿把 JC-1 Buffer(5 )全部配制成 1 ，因為操作過程中需直接使用 JC-1 Buffer(5 )。6、 如 JC-1 Buffer(5 )中有沉淀，必須全部溶解后才能使用，為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱。7、 CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑，有一定毒性，請注意小心防護(hù)。

 

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