大部分組織細(xì)胞離體培養(yǎng)時，會以貼壁的形式生長（除了取自血、脾或骨髓的細(xì)胞）;完全培養(yǎng)基中的血清，含有許多帶陽性電荷的促細(xì)胞附著因子（層黏連蛋白 Laminine、纖維鏈接蛋白 Fibronectin 等胞外基質(zhì)），能幫助細(xì)胞附著于帶陰性電荷的底物上（玻璃或塑料培養(yǎng)容器），并形成鍵結(jié)、貼壁伸展。

 

▲ 陽性電荷的促細(xì)胞附著因子，能幫助細(xì)胞附著于帶陰性電荷的底物上

所以當(dāng)細(xì)胞長滿需要分盤的時后，就要想辦法讓細(xì)胞和培養(yǎng)底物說 再見！也就是所謂的～
 

細(xì)胞消化Cell Detachment

常見細(xì)胞消化法有以下三種：

物理機(jī)械法 離子螯合法 酶消化法 物理機(jī)械法

直接用液體吹打或用刮刀，施予外力讓細(xì)胞與培養(yǎng)底物分離；適用于貼壁性弱的細(xì)胞傳代，但相較于其它消化方法，這種外力無法量化控制，細(xì)胞分散效果差，且可能會造成大量細(xì)胞破損，使內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基，進(jìn)而影響細(xì)胞傳代狀態(tài)。

▲細(xì)胞刮勺

離子螯合法

細(xì)胞膜表面蛋白大多需要鈣、鎂離子來維持與胞外基質(zhì)的穩(wěn)定鍵結(jié)，當(dāng)然也包含各種黏附蛋白（例：整合素、鈣黏著蛋白、橋粒等），螯合劑會在不破壞細(xì)胞膜表面蛋白的狀況下，抽離這些離子，使黏附蛋白失活而減少細(xì)胞-細(xì)胞間及細(xì)胞-底物間的連接作用，讓細(xì)胞較容易在施予外力時，脫離培養(yǎng)底物并促進(jìn)細(xì)胞分散。

0.02% EDTA是細(xì)胞傳代最常用的離子螯合劑，在37℃作用效果最佳（消化較敏感的細(xì)胞可在4℃作用），適用于消化一般貼壁性細(xì)胞或細(xì)胞表面標(biāo)記實驗細(xì)胞。

但EDTA無法用血清終止其反應(yīng)，所以在消化細(xì)胞后必須用緩沖鹽溶液（如：PBS）清洗離心，以免影響后續(xù)細(xì)胞貼盤效果。

 

▲ EDTA（黑）能螯合二價離子（紅）

酶消化法

用蛋白水解酶消化連接細(xì)胞及培養(yǎng)底物的蛋白質(zhì)，適用于消化貼壁性稍強(qiáng)的細(xì)胞。

目前常用蛋白水解酶主要有兩種：

為一種來自于胰腺的絲氨酸蛋白酶；能辨識并剪切勝肽鏈中的賴氨酸（Lys）和精氨酸（ Arg）羧基端（兩者之一緊跟脯氨酸狀況除外），所以能直接作用在細(xì)胞外的黏附蛋白及胞外基質(zhì)上，但如果作用時間過長，細(xì)胞膜上內(nèi)嵌的其他蛋白也會被水解，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損；不同細(xì)胞適合的胰蛋白酶使用濃度及作用時間都各有不同。

使用胰蛋白酶消化前，請先用不含鈣、鎂離子的平衡鹽溶液清洗細(xì)胞，因為血清中的抗凝血酶III及平衡鹽溶液中的鈣、鎂離子，都會降低胰蛋白酶活性，導(dǎo)致消化效果不佳；消化完畢后，可直接用含血清的培養(yǎng)基或其他胰蛋白酶抑制劑終止消化反應(yīng)。

為一種膠原水解酶，大多由細(xì)菌提取而來；能辨識并剪切Pro-X-Gly-Pro勝肽序列，而此序列在胞外基質(zhì)主成分-膠原蛋白中出現(xiàn)的頻率比一般蛋白高很多，使得膠原酶能較專一的作用在胞外基質(zhì)上，所以對細(xì)胞的傷害比胰蛋白酶小，且在鈣、鎂離子環(huán)境中仍有活性，可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，操作簡便，但膠原酶價格較高，大量使用將增加實驗成本。

細(xì)胞還是不愿意跟底物說再見！咋辦？

面對貼壁性極強(qiáng)的細(xì)胞，可進(jìn)一步使用 含EDTA的胰蛋白酶 來消化細(xì)胞，EDTA會抓住細(xì)胞表面未洗凈的鈣、鎂離子，降低黏附蛋白活性使細(xì)胞不會彼此粘黏，同時讓胰蛋白酶在不受鈣、鎂離子干擾下發(fā)揮最大作用剪切胞外基質(zhì)及黏附蛋白，讓細(xì)胞順利脫離培養(yǎng)底物且減少細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象。

細(xì)胞消化小技巧

不一定要一次把所有細(xì)胞都要消化下來！

晃動培養(yǎng)盤并在顯微鏡下用肉眼觀察，只要70~80%細(xì)胞都收縮了或超過適合消化時間，就該終止消化反應(yīng)，如果細(xì)胞量夠即可進(jìn)行后續(xù)傳代或?qū)嶒灢襟E；如果細(xì)胞量不夠，則可視情況用不含鈣、鎂離子的平衡鹽溶液清洗仍貼壁的細(xì)胞，再進(jìn)行一次消化反應(yīng)。

 

▲ 消化不下來的細(xì)胞（黃）請視情況決定是否再消化一次。

不一定要吹打成完全單細(xì)胞懸液！

一般細(xì)胞脫離培養(yǎng)底物、并經(jīng)過5~10次輕柔吹打后，會在細(xì)胞懸液里形成小規(guī)模聚集(約5~10顆細(xì)胞)，所以不需要過度延長消化時間想讓細(xì)胞完全分離成單細(xì)胞懸液。

消化效果不佳，先提升消化液濃度、再加長作用時間！

當(dāng)你選定了一種消化方式 (物理機(jī)械法除外)，發(fā)現(xiàn)效果不佳，首先應(yīng)考慮提高EDTA或胰酶濃度，效果再不佳才加長消化的作用時間，避免細(xì)胞長時間浸泡在消化液中造成的細(xì)胞膜損傷。

（一般消化液使用：0.02%~0.04% EDTA作用5-20分鐘；0.2~0.5% 胰蛋白酶作用1~5分鐘）
 

結(jié)語

 細(xì)胞消化 ，是一個看似很簡單，但是有很多技術(shù)含量的步驟。消化好壞、是否污染、有無受傷，都在這短短的五六分鐘里決定。

當(dāng)我們已經(jīng)可以順利操作細(xì)胞培養(yǎng)實驗，接下來要思考的，就是如何讓細(xì)胞長得更健康、更均一、做出來的實驗才會更完美。

祝各位的細(xì)胞都顆顆透亮、粒粒分明、活力旺盛！

 

BI細(xì)胞培養(yǎng)小課堂