在剛剛過去的蘇州標記免疫分析專業(yè)委員會2019學(xué)術(shù)峰會上，浙江清華長三角研究院分析測試中心蔡強主任詳細講述了分子診斷IVD設(shè)備的發(fā)展史。

蔡強 研究員

浙江清華長三角研究院分析測試中心 主任

國家食品安全風(fēng)險評估中心應(yīng)用技術(shù)合作中心 副主任

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷在臨床診斷中的技術(shù)主要包括PCR技術(shù)、芯片技術(shù)和測序技術(shù)。臨床檢測中，分子診斷越來越受到重視，但市場占比與生化診斷、免疫診斷相比，還存在一定的差距。

目前分子診斷在體外診斷中的主要的應(yīng)用領(lǐng)域，包括對病毒、細菌等微生物的篩查及定性定量檢測，藥物篩選及用藥分析以及基因早期的分析。在微生物檢驗檢測方面，分子診斷相對于免疫診斷具有一定的優(yōu)勢；基因圖譜分析方面，雖然目前相關(guān)研究很多，但在該領(lǐng)域應(yīng)用的臨床價值還有待發(fā)掘。

分子診斷在體外診斷中的位置

分子診斷和微生物診斷存在一定的關(guān)聯(lián)性，微生物診斷是外部特性分析，而分子診斷則是對內(nèi)部分子的檢測。

表1 分子診斷在體外診斷中的位置 

種類

細分

檢測原理

應(yīng)用領(lǐng)域

優(yōu)點

缺點

分子診斷

PCR

DNA高溫變成單鏈，低溫互補配對鏈合成

病毒、細菌

特異性強、靈敏度高

檢測通量較小

原位雜交

定標記的一致順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程

基因圖譜、病毒檢測

成本較低

精度相對低、檢測通量較小

基因芯片

測序原理是雜交測序方法，在一塊基片表面固定了序列一直的把核苷酸的探針，互補匹配確定序列

藥物篩選、新藥開發(fā)、疾病診斷

簡單、便捷、準確

檢測通量較小

基因測序

從血液或唾液中分析測定基因全序列，預(yù)測罹患多種疾病的可能性

基因圖譜、糖篩等

信息量大、通量高、準確

成本高、耗時較長

微生物診斷

藥敏試驗

體外測定藥物抑菌或殺菌能力的試驗

實驗室檢驗

準確

操作要求高

培養(yǎng)+形態(tài)觀察

對細菌培養(yǎng)觀察菌落

細菌、真菌

簡單、成本低

耗時

全自動微生物分析系統(tǒng)

細菌鑒定的生化反應(yīng)

細菌、真菌

簡單、快速

成本高

血液物診斷

涂片+鏡檢

異型血溶血現(xiàn)象

血型檢驗等

方便快捷

檢測范圍有限

血細胞分析

通過一些儀器的檢測對紅細胞、白細胞等進行分析

紅細胞、白細胞、血小板等檢測

定量，準確

檢測范圍有限

流式細胞術(shù)

以高速分析上萬個細胞，濱能同時從一個細胞中測得多個參數(shù)

紅細胞、白細胞、血小板等檢測

速度快、精度高、準確性好

成本較高

其他

POCT

即時檢測原理依不同設(shè)備不同

心臟標記物肝素抗凝等

快速簡單、綜合成本低

精度相對較低

分子診斷主要技術(shù)發(fā)展的時間軸

早期的分子診斷設(shè)備，多為大型集成化設(shè)備，包含很多的操作模塊。在原理上，早期的設(shè)備并無很多創(chuàng)新，主要是將多種手工操作內(nèi)容自動化和集成化，發(fā)展到基因芯片，才有了原理性的突破。1990年提出的人類基因組計劃、后來的蛋白組學(xué)以及從近期開始的微生物組計劃，極大的推動了分子診斷設(shè)備的發(fā)展。產(chǎn)品方面，較早期時有Affymetrix公司推出的第一塊商業(yè)化基因芯片。

接下來是PCR儀器的發(fā)展。早期的PCR儀器，是簡單的DNA解鏈、復(fù)制、復(fù)性等過程，除了水浴鍋自動化，并沒有太多技術(shù)含量。數(shù)字PCR技術(shù)出現(xiàn)后， 與生物信息學(xué)和微型加工技術(shù)關(guān)聯(lián)起來，發(fā)展速度很快。再后來出現(xiàn)了微流控技術(shù)和基因測序技術(shù)?；驕y序技術(shù)經(jīng)歷了一代、二代、三代，目前測序技術(shù)，仍然是重要的發(fā)展方向。

分子診斷主要技術(shù)發(fā)展的時間軸

前處理復(fù)雜導(dǎo)致分子診斷的現(xiàn)場應(yīng)用成為瓶頸

分子診斷和免疫診斷、生化診斷設(shè)備不同的地方，很大程度在于樣品前處理。免疫檢測對象主要是一些游離的大分子，處理相對容易，但分子診斷樣本處在細胞當中，處理過程容易被污染，因此前處理系統(tǒng)相對復(fù)雜。

分子診斷系統(tǒng)的組成包括樣本前處理系統(tǒng)、檢測處理系統(tǒng)和分析處理系統(tǒng)。樣本前處理系統(tǒng)依據(jù)其功能的豐富程度又包括移液操作和核酸提取兩個平臺，依據(jù)使用場所不同分為實驗室自動化平臺和現(xiàn)場前處理平臺。

目前前處理設(shè)備中，全自動的移液工作站是比較成功的設(shè)備。它是一種全自動、高精度移液系統(tǒng)，專門用于小體積的PCR、qPCR體系配置，能夠完全替代手工，保證了配置實驗擴增體系的正確性、精密度及重復(fù)性。缺點是功能單一，臨床及科研應(yīng)用尚有一定局限性。

貝克曼自動化工作站Biomek i7

核酸提取設(shè)備，主要是自動核酸提取儀，該儀器集成了自動移液工作站和標準耗材，在以其預(yù)設(shè)程序控制下進行核算分離的儀器，這一類自動化系統(tǒng)在科研和臨床中應(yīng)用最為廣泛。提取方法的核心是免疫磁珠，包括磁珠吸附和磁珠分離等。除磁珠提取純化方法外，還有其他純化方法，如柱層析法。

托摩根核酸提取儀 MM96

目前，現(xiàn)場分子診斷還存在諸多問題。免疫檢測中可用試紙條等材料，檢測方便，但是分子診斷沒有這類材料可用，主要原因是樣品前處理無法達到這種檢測目的。當現(xiàn)場檢測時，在很開放的環(huán)境下，如何提取純化DNA，目前仍沒有簡易方法?，F(xiàn)場檢測的需求，目前在醫(yī)院的臨檢中心還不大，對于基層的衛(wèi)生所，或許會存在這樣的需求，從這個問題也引發(fā)出醫(yī)療模式應(yīng)該往什么方向發(fā)展的思考。

分子診斷的三大檢測平臺

分子診斷主要的檢測平臺為PCR儀、芯片系統(tǒng)以及基因測序平臺。

PCR儀——數(shù)字PCR是未來發(fā)展趨勢

分子診斷設(shè)備另一個重要的組成內(nèi)容是PCR儀器。常規(guī)的PCR目前技術(shù)上可提升的空間很有限，但很多部件只有少數(shù)幾家廠家做的不錯。

熒光定量PCR，國內(nèi)有很多廠家生產(chǎn)，技術(shù)、元器件等各方面正在迅速趕超國外儀器廠商水平，但這未必是國內(nèi)廠商最終的發(fā)展方向。得益于光源及檢測器件小型化趨勢，現(xiàn)在的熒光PCR儀越來越小型化。

數(shù)字PCR是PCR領(lǐng)域未來發(fā)展的趨勢，目前有一些廠商在研究生產(chǎn)，比如新羿生物、領(lǐng)航基因等?，F(xiàn)在數(shù)字PCR的售價很高，主要原因是后端檢測器件靈敏度要求高，成像器件技術(shù)先進，造成成本偏高。當然，因為數(shù)字PCR有絕對定量的功能，對于分子檢測意義重大。建議國內(nèi)PCR儀器廠商，不要只關(guān)注熒光定量PCR，可向數(shù)字PCR發(fā)展。

銳訊生物Rainsure液滴式數(shù)字PCR儀DropX-1000

微滴式數(shù)字PCR的檢測流程

表2 3種PCR的比較

Routine PCR

Real-time PCR

Digital PCR

是否定量

否，但是比較凝膠上的擴增條帶的強度與一直濃度的標準品可提供“半定量”的結(jié)果

是，因為在PCR的指數(shù)（對數(shù)）期內(nèi)采集數(shù)據(jù)，在此期間PCR產(chǎn)物的數(shù)量與核酸模板的量成正比

是，陰性，PCR反應(yīng)的比例適合泊松統(tǒng)計法

應(yīng)用

測序
基因分型
分子克隆

基因表達定量
芯片驗證
質(zhì)量控制與檢測驗證
病原體檢測
SNP基因分型
病毒定量
microRNA分析
siRNA/RNAi實驗

病毒載荷絕對定量
下一代測序文庫絕對定量
稀有等位基因檢測
基因表達絕對定量
混合物富集和分離
核酸標準品絕對定量

總結(jié)

傳統(tǒng)PCR的缺點：
精確度差
靈敏度低
動態(tài)范圍小, 2logs
分辨率低
非自動化
僅限基于規(guī)格的區(qū)別分析
結(jié)果未表示為數(shù)字
使用溴化乙錠染色不足一定量
PCR后需處理

是是熒光定量PCR的優(yōu)點：
1.提高檢測的動態(tài)范圍
2.無需PCR后處理
3.檢測能夠覆蓋低至2倍的變化
4.在PCR的煮熟器內(nèi)采集數(shù)據(jù)
5.報告基團熒光信號的增加與生產(chǎn)的擴增子數(shù)量成正比
6.裂解探針提供擴增子的永久裂解記錄

數(shù)字PCR的優(yōu)點：
1.無需以來參考物或標準品
2.通過增加PCR平行樣的綜述可實現(xiàn)所需要的精度
3.高度耐受抑制劑
3.能夠分析復(fù)雜混合物
5.與傳統(tǒng)的qPCR不同，數(shù)字PCR對出現(xiàn)的拷貝數(shù)呈線性反應(yīng)，可以檢測到較小倍數(shù)變化的差異。

DNA微陣列——基因芯片

熒光原位雜交（FISH），是一種傳統(tǒng)方法，對于原位切片的分析有一定的意義。儀器本身比較簡單，就是熒光顯微鏡，外加一個殼構(gòu)成的一個圖像分析儀。檢測過程是在一定的溫度下將切片加入設(shè)備中，成像。雜交的另一種方式是利用芯片進行，主要是DNA微陣列芯片。芯片技術(shù)從上世紀90初期開始研究到現(xiàn)在，已經(jīng)有近三十年時間，目前已經(jīng)應(yīng)用到診斷當中，用做疾病篩查。熒光原位雜交最核心的地方在于診斷試劑而非設(shè)備。目前的檢測方式主要采用熒光標記的方式，在靈敏度方面，已經(jīng)能夠滿足檢測要求，因此化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光標記方式相對較少。

美谷分子GenePix 4300A&4400A微陣列基因芯片掃描儀

第四代基因測序成為資本追逐熱點

基因測序的發(fā)展，從最早獲得諾貝爾獎的一代，到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到第四代。原理上，第一代測序儀可認為是人工操作方法的儀器實現(xiàn)，相對比較簡單?，F(xiàn)在的第三代測序和第四代測序的原理已有一定區(qū)別。目前，高通量測序的需求很大，發(fā)展很迅速，國內(nèi)在基因測序儀器的發(fā)展也將會越來越快。第三代和四代測序儀的價值在于直接讀取功能大，但成本很高，測序時間長。把測序降到10美元以下是全球相關(guān)企業(yè)追求的目標，如果實現(xiàn)，測序在診斷中的應(yīng)用將會更多的取代其他技術(shù)。

 基因測序技術(shù)進展

四代測序，即納米孔技術(shù)測序，目前已經(jīng)成為資本市場追逐的熱點，容量約為幾十億美元。原理很簡單，就是DNA鏈打開后穿過一個很細的孔，單個堿基對通過納米尺寸的通道時，會引起通道點穴性能的變化。四代測序具有高讀長、易集成、小型化、高速度、大通量等優(yōu)勢。納米孔所通電流很小，為10-18-10-15A，遠低于熒光檢測電流，所以目前檢測時間大約需要幾個小時到十幾個小時，隨著技術(shù)的不斷進步，后期有望將測序時間縮短到半小時。

納米孔主要包括兩大類生物納米孔和固態(tài)納米孔。生物大分子納米孔發(fā)展較早，已經(jīng)有了相應(yīng)的設(shè)備，體積很小，準確率較低。固態(tài)納米孔，目前還是實驗室水平，有少數(shù)四代測序公司已經(jīng)開始做固態(tài)納米孔測序儀。固態(tài)納米孔的檢測方式很多，在基底上做一些材料摻雜，具有半導(dǎo)體特性，可替代光學(xué)器件，精確度也等性能指標更好。因為固態(tài)納米孔使用的是標準的微電子工藝，如果可以規(guī)?；a(chǎn)，可以降低測序儀生產(chǎn)成本，值得推廣。

測序結(jié)束后，數(shù)據(jù)處理比其他診斷方法更為復(fù)雜。免疫檢測的IVD設(shè)備后期用到的主要是數(shù)據(jù)庫管理，無需數(shù)據(jù)處理，但是分子診斷數(shù)據(jù)需要用算法進行處理，這些算法也就是生物信息學(xué)的發(fā)展源頭。目前來講，做算法的人才和做軟件的人才都并不缺乏，缺乏的是能夠?qū)⑺惴ㄗ龀绍浖娜瞬?，這是基本事實。目前很多高校已經(jīng)發(fā)表了很多算法相關(guān)的論文，但是軟件依舊很少。目前很多檢測機構(gòu)所用的數(shù)據(jù)分析軟件多是英文軟件，很多還是開源軟件，這種軟件不適合醫(yī)院檢驗使用。因此，數(shù)據(jù)處理軟件不足，對測序設(shè)備在臨床的應(yīng)用是個非常棘手的問題。

除了上述測序技術(shù)，DNA條形碼與測序結(jié)合起來，未來在臨床上或可發(fā)揮一定的作用。DNA條形碼是利用標準的、有足夠變異的、易擴增、較短的DNA片段在物種內(nèi)的的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識別系統(tǒng)。目前主要用于物種鑒定。

小結(jié)主要觀點

1. 四代測序、DNA條形碼、全基因組測序等技術(shù)高速發(fā)展，臨床價值需要拓展，國產(chǎn)設(shè)備仍然聚焦于早期技術(shù)，新技術(shù)設(shè)備十分缺乏。

2. 樣品前處理設(shè)備普遍缺乏，尤其是在現(xiàn)場應(yīng)用的環(huán)節(jié)

3. 無論是PCR、前處理還是測序，精細加工與芯片系統(tǒng)已經(jīng)走到歷史舞臺，國產(chǎn)設(shè)備需造作準備。

 整理自蔡強在標記免疫分析專業(yè)委員會2019學(xué)術(shù)峰會IVD設(shè)備論壇上所作報告