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采用Agilent Femto Pulse系統(tǒng)對(duì)不同基因組DNA提取進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估
點(diǎn)擊次數(shù)：11 發(fā)布日期：2019-6-24
來源：本站 僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
摘要
Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)采用革命性設(shè)計(jì)，是唯一一款能夠自動(dòng)進(jìn)行高分子量(HMW) gDNA 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (PFGE)分析的儀器。與傳統(tǒng) PFGE 分析相比，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)能夠在更短時(shí)間內(nèi)對(duì)gDNA 分子量和完整性進(jìn)行定性分析。應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋三代測(cè)序或長讀長測(cè)序平臺(tái)的小基因組分析到復(fù)雜基因組從頭組裝，這些應(yīng)用要求HMW gDNA 樣品滿足高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。有多種方法針對(duì)特定的下游應(yīng)用從選取的真核和原核來源樣品中分離gDNA。而分離gDNA 的分子量和質(zhì)量會(huì)受到不同提取方法的影響，因此需要對(duì) gDNA 樣品進(jìn)行可靠的質(zhì)量評(píng)估。安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒專為 Femto Pulse 系統(tǒng)上的 HMW gDNA 分離而設(shè)計(jì)，可提供準(zhǔn)確而重現(xiàn)的分子量和質(zhì)量評(píng)估。利用基因組 DNA 165 kb 分析試劑盒在 Femto Pulse 系統(tǒng)上對(duì)比五種不同gDNA 提取方法得到的gDNA 分子量和質(zhì)量。
前言
大片段基因組文庫（如用于10X Genomics、Oxford Nanopore 和PacBio Technologies 的文庫）需要起始基因組 DNA (gDNA) 滿足特定質(zhì)量條件才能成功獲得結(jié)果。影響樣品質(zhì)量的幾個(gè)因素包括：提取方法、樣品儲(chǔ)存、反復(fù)凍融循環(huán)和變性[1]。在提取和處理 gDNA 期間，DNA 可以在許多不同環(huán)節(jié)發(fā)生物理、酶促和化學(xué)剪切，變?yōu)樾∑?。因此，?zhǔn)確可靠的 gDNA 質(zhì)量評(píng)估對(duì)于這些下游測(cè)序過程的成功至關(guān)重要。通過確定樣品的片段化和降解程度，部分評(píng)估 gDNA 質(zhì)量。過夜脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (PFGE) 通常用于評(píng)估高分子量 (HMW) gDNA 的完整性。配備基因組DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)是市面上唯一一款用自動(dòng)分離系統(tǒng)替代PFGE 的解決方案，可在短短 70 分鐘內(nèi)評(píng)估HMW gDNA。
實(shí)驗(yàn)部分
將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株 BY4741（ Dharmacon，部件號(hào)YSC1048）在 YPD 肉湯培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司，部件號(hào) A1374501）中培養(yǎng) 24 小時(shí)。離心收集細(xì)胞，再按照若干種方案提取 gDNA。方法 A 采用經(jīng)典的苯酚-氯仿-異戊醇 (25:24:1)（賽默飛世爾科技公司，部件號(hào) AC327111000）提取方案[2]，方法 B、C、D、E 根據(jù)以下四種不同市售試劑盒的制造商說明書進(jìn)行：
Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒（Promega Life Sciences，部件號(hào) A1120）、Quick- DNA 通用試劑盒（Zymo Research，部件號(hào) D4068T）、MegaLong gDNA 試劑盒（G-Biosciences，部件號(hào) 786-146）、Genomic-tip 20/G 以及基因組 DNA 緩沖液組合（Qiagen，部件號(hào) 10223 和19060）。方法 B 是液相提取，方法 C 和E 是離心柱提取，方法 D 是膜提取。分別通過 PFGE 以及在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒（部件號(hào) Fp-1002-0275） 的 Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)（部件號(hào)FPv1-CE2）上采用 FP-1002-22 gDNA 165 kb 方法（快速法）或 FP-1002E22 擴(kuò)展 gDNA 165 kb 法（擴(kuò)展法），對(duì)提取的 gDNA 進(jìn)行分離。在 Femto Pulse 系統(tǒng)操作軟件中選擇基因組 DNA 165 kb 快速和擴(kuò)展法。將 50 ng/ L 左右 gDNA上樣至 0.8% 瓊脂糖凝膠（Lonza SeaKem Agarose，部件號(hào) 50152），并用 Pippin- Pulse 預(yù)設(shè)方案（ 5 至 150 kb）通過PFGE 分離 18 小時(shí) (Sage Sciences)。使用 Agilent FP 165 kb 分子量標(biāo)準(zhǔn)品（165、50、42、23、21、17.7、10 kb）（部件號(hào) FP-7002-U035）和低范圍 PFG 標(biāo)準(zhǔn)品（New England Biolabs，部件號(hào)N0350S）。分離后，用 Agilent FP 嵌入染料（部件號(hào) FP-6001-U030）對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行后染色，并用紫外透照儀觀察。
結(jié)果與討論
在 Femto Pulse 系統(tǒng)上用快速和擴(kuò)展基因組 DNA 165 kb 方法測(cè)定分子量分布
Femto Pulse 系統(tǒng)軟件為基因組 DNA165 kb 試劑盒提供了兩種分離方法。快速法是一種 70 分鐘的脈沖場(chǎng)毛細(xì)管電泳 (CE) 分離，最適合對(duì) 80 kb 以下的 gDNA 樣品進(jìn)行分離與分子量測(cè)定。擴(kuò)展法采用另一種持續(xù) 3.5 小時(shí)的脈沖場(chǎng) CE 分離方法，專用于改善大于 80 kb 的 gDNA 樣品的分離和分子量測(cè)定。用快速法分離的大于 80 kb 的基因組 DNA 峰形尖銳、緊湊，與 165 kb 左右 DNA 的片段峰形相似[3]。導(dǎo)致這一結(jié)果的部分原因?yàn)槊}沖場(chǎng)分離期間用于樣品分離的時(shí)間太短。擴(kuò)展法在更長的分離時(shí)間中使用了脈沖場(chǎng) CE 替代方法，并將相同 gDNA 樣品分離為更寬的彌散條帶，更能代表樣品的整體分子量范圍。擴(kuò)展法推薦用于大于 80 kb 的 gDNA 樣品（快速法僅能將其分離為 165 kb 左右的緊湊峰）。
Femto Pulse 系統(tǒng)使用基因組 DNA 165 kb擴(kuò)展法來分離大于 80 kb 的提取 gDNA（圖 1）。使用 Agilent ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件上的 Smear Analysis 選項(xiàng)卡分析gDNA 的分子量分布。彌散條帶分子量分布包含整個(gè)彌散條帶范圍內(nèi)的濃度分布。酵母 gDNA 的彌散條帶分子量分布和完整性隨使用的提取方法不同而變化。使用提取方法 A、B、C、D、E 得到的基因組 DNA 樣品的彌散條帶分子量依次減?。ū?1）。液相提取法 A 和 B 得到了分子量最大的完整 gDNA 彌散條帶。用傳統(tǒng)液體苯酚-氯仿提取法 (A) 提取的基因組 DNA 產(chǎn)生的完整 gDNA 較長，平均為163670 bp，而另一種液相提取方法 B 為
103111 bp。方法 C 離心柱 gDNA 提取方法和方法 D 膜 gDNA 提取方法，在五種不同提取方法中表現(xiàn)出相似的彌散條帶分子量分布結(jié)果。
在使用基因組 DNA 165 kb 擴(kuò)展法分析時(shí)，方法 E 離心柱 gDNA 提取方法得到的電泳圖顯示整個(gè) gDNA 樣品均分子量小于 80 kb。因此，將使用快速法和擴(kuò)展法分析的方法 E 樣品進(jìn)行對(duì)比（圖 2）。兩種方法對(duì)樣品 E 得到的彌散條帶分子量相近，為 30579 和 27388 bp（分別對(duì)應(yīng)于快速法和擴(kuò)展法）。在此示例中， 1 小時(shí)的快速法運(yùn)行時(shí)間更短，故優(yōu)于擴(kuò)展法。
Femto Pulse 系統(tǒng)與脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 的對(duì)比
過去，16 至 18 小時(shí)的 PFGE 分析是測(cè)定 50 kb 以上 gDNA 質(zhì)量和分子量的唯一選擇。隨著技術(shù)的進(jìn)步，F(xiàn)emto Pulse系統(tǒng)成為唯一一款能夠在短短 70 分鐘內(nèi)評(píng)估165 kb 以內(nèi) gDNA 分子量和質(zhì)量的儀器。用 Femto Pulse 系統(tǒng)取代過夜運(yùn)行的PFGE，省去了數(shù)天專門用于質(zhì)量控制檢查的時(shí)間，從而節(jié)省了時(shí)間和金錢。ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件自動(dòng)提供峰分子量、電泳圖和數(shù)字化膠圖，實(shí)現(xiàn)樣品質(zhì)量和分子量的快速測(cè)定。相比之下，PFGE運(yùn)行需要采用額外軟件進(jìn)行用戶評(píng)估，以獲得計(jì)算分子量值。此外，F(xiàn)emto Pulse系統(tǒng)將樣品起始量降至皮克級(jí)，節(jié)省了寶貴的樣品材料。
對(duì)于測(cè)試的所有提取方法，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)擴(kuò)展法與 PFGE 凝膠得到的 ProSize 數(shù)字化膠圖中的 gDNA 濃縮條帶區(qū)域具有相近的分子量（圖 3）。Femto Pulse 系統(tǒng)的高靈敏度使其能夠檢出因濃度低而無法在 PFGE 上檢出的完整 gDNA 彌散條帶范圍。此外，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)的出色分
辨率有助于區(qū)分用方法 B、C、D 提取的分子量相近的gDNA 樣品。
基因組質(zhì)量值 (GQN)
提取 DNA 的質(zhì)量會(huì)因?yàn)樘崛》椒?、樣品處理和組織類型的不同產(chǎn)生很大差異。因此，在使用樣品前通過質(zhì)量控制分析來確定高度完整的 gDNA 十分重要?；蚪M質(zhì)量值(GQN) 專為ProSize 設(shè)計(jì)，可以輕松
實(shí)現(xiàn)定制化的 gDNA 質(zhì)量評(píng)估。用戶可針對(duì)其特定應(yīng)用設(shè)定合適的分子量閾值。然后，ProSize 根據(jù)高于指定分子量閾值的總測(cè)量濃度分?jǐn)?shù)計(jì)算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等級(jí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)分，0 表示樣品均未超過閾值，10 表示 100% 的樣品高于閾值。
在需要分析不同分子量的 gDNA 時(shí)，能設(shè)置可自定義的 GQN 分子量閾值是一項(xiàng)巨大的優(yōu)勢(shì)。用戶可以根據(jù)具體樣品確定合適的分子量閾值，以便客觀判斷哪些樣品可滿足用戶要求。將方法 A、B、C、D、
E 提取的酵母 gDNA 的 GQN 分子量閾值設(shè)為 50 kb。隨著 gDNA 樣品分子量的減小，GQN 分別為 8.2、7.4、6.1、3.0、1.1（分別對(duì)應(yīng)于方法 A、B、C、D、E， 表 1），與預(yù)期相同。GQN 還表示高于分子量閾值的樣品百分比。例如，GQN 8.2 表示高于 50 kb 閾值的樣品占 82%。也就是說，有 18% 的樣品低于閾值。方法C 和 D 得到的分子量相近（分別為 77 和 62 kb），但得到的 GQN 分別為 6.1 和
3.0，差異很大。GQN 所反映出的差異主要是由于彌散條帶分布不同，因此相近平均分子量的 gDNA 的質(zhì)量水平不同。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應(yīng)用的樣品時(shí)，需要同時(shí)考慮樣品的分子量和質(zhì)量。
結(jié)論
Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)是唯一能夠替代HMW gDNA 過夜 PFGE 分析的自動(dòng)化系統(tǒng)，可以在 70 分鐘內(nèi)完成分析，大大節(jié)省時(shí)間和金錢。此外，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)將樣品起始量降至皮克級(jí)，節(jié)省了寶貴的樣品材料。Agilent ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件能夠報(bào)告用戶定義的 GQN 質(zhì)量評(píng)分，該評(píng)分客觀代表了每個(gè)樣品中 HMW gDNA 的百分比。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應(yīng)用的樣品時(shí)，同時(shí)需要考慮樣品分子量和質(zhì)量。使用 Femto Pulse 系統(tǒng)和安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒對(duì)比了通過不同方法提取的 DNA 樣品的分子量和質(zhì)量。與其他液相、離心柱和膜提取方法相比，傳統(tǒng)酚-氯仿提取方法得到的 gDNA 最長且最完整。Femto Pulse 系統(tǒng)具有極高的分辨率，可以區(qū)分平均分子量相近的 gDNA 樣品間的不同分子量分布，這是傳統(tǒng)PFGE 無法實(shí)現(xiàn)的功能。
參考文獻(xiàn)
1. Pocernich, C.; Uthe J.; Wong K-S. Quality Assessment of Genomic DNA for Biobanking Samples（用于生物樣本庫樣品的基因組 DNA 質(zhì)量評(píng)估），安捷倫科技公司應(yīng)用簡報(bào)， 出版號(hào) 5994-0520ZHCN，2018
2. Fan, H.; Gulley, M. L. DNA Extraction from Fresh or Frozen Tissues.In Methods in Molecular Medicine: Molecular Pathology Protocols, Killeen, A. A., Ed.; Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001; vol. 49, pp 5 10
3. Pocernich, C.; Uthe, J.; Wong, K-S. Genomic DNA Sizing andQuality Control on the Agilent FemtoPulse System（在 Agilent FemtoPulse 系統(tǒng)上進(jìn)行基因組 DNA 分子量測(cè)定與質(zhì)量控制），安捷倫科技公司應(yīng)用簡報(bào)，出版號(hào) 5994-0516EN，2017
僅限研究使用。不可用于診斷目的。
本文中的信息、說明和指標(biāo)如有變更，恕不另行通知。
2019 年 3 月 5 日，中國出版
安捷倫科技（中國）有限公司，2019
5994-0754ZHCN
摘要
Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)采用革命性設(shè)計(jì)，是唯一一款能夠自動(dòng)進(jìn)行高分子量(HMW) gDNA 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (PFGE)分析的儀器。與傳統(tǒng) PFGE 分析相比，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)能夠在更短時(shí)間內(nèi)對(duì)gDNA 分子量和完整性進(jìn)行定性分析。應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋三代測(cè)序或長讀長測(cè)序平臺(tái)的小基因組分析到復(fù)雜基因組從頭組裝，這些應(yīng)用要求HMW gDNA 樣品滿足高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。有多種方法針對(duì)特定的下游應(yīng)用從選取的真核和原核來源樣品中分離gDNA。而分離gDNA 的分子量和質(zhì)量會(huì)受到不同提取方法的影響，因此需要對(duì) gDNA 樣品進(jìn)行可靠的質(zhì)量評(píng)估。安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒專為 Femto Pulse 系統(tǒng)上的 HMW gDNA 分離而設(shè)計(jì)，可提供準(zhǔn)確而重現(xiàn)的分子量和質(zhì)量評(píng)估。利用基因組 DNA 165 kb 分析試劑盒在 Femto Pulse 系統(tǒng)上對(duì)比五種不同gDNA 提取方法得到的gDNA 分子量和質(zhì)量。
前言
大片段基因組文庫（如用于10X Genomics、Oxford Nanopore 和PacBio Technologies 的文庫）需要起始基因組 DNA (gDNA) 滿足特定質(zhì)量條件才能成功獲得結(jié)果。影響樣品質(zhì)量的幾個(gè)因素包括：提取方法、樣品儲(chǔ)存、反復(fù)凍融循環(huán)和變性[1]。在提取和處理 gDNA 期間，DNA 可以在許多不同環(huán)節(jié)發(fā)生物理、酶促和化學(xué)剪切，變?yōu)樾∑?。因此，?zhǔn)確可靠的 gDNA 質(zhì)量評(píng)估對(duì)于這些下游測(cè)序過程的成功至關(guān)重要。通過確定樣品的片段化和降解程度，部分評(píng)估 gDNA 質(zhì)量。過夜脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (PFGE) 通常用于評(píng)估高分子量 (HMW) gDNA 的完整性。配備基因組DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)是市面上唯一一款用自動(dòng)分離系統(tǒng)替代PFGE 的解決方案，可在短短 70 分鐘內(nèi)評(píng)估HMW gDNA。
實(shí)驗(yàn)部分
將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)菌株 BY4741（ Dharmacon，部件號(hào)YSC1048）在 YPD 肉湯培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司，部件號(hào) A1374501）中培養(yǎng) 24 小時(shí)。離心收集細(xì)胞，再按照若干種方案提取 gDNA。方法 A 采用經(jīng)典的苯酚-氯仿-異戊醇 (25:24:1)（賽默飛世爾科技公司，部件號(hào) AC327111000）提取方案[2]，方法 B、C、D、E 根據(jù)以下四種不同市售試劑盒的制造商說明書進(jìn)行：
Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒（Promega Life Sciences，部件號(hào) A1120）、Quick- DNA 通用試劑盒（Zymo Research，部件號(hào) D4068T）、MegaLong gDNA 試劑盒（G-Biosciences，部件號(hào) 786-146）、Genomic-tip 20/G 以及基因組 DNA 緩沖液組合（Qiagen，部件號(hào) 10223 和19060）。方法 B 是液相提取，方法 C 和E 是離心柱提取，方法 D 是膜提取。分別通過 PFGE 以及在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒（部件號(hào) Fp-1002-0275） 的 Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)（部件號(hào)FPv1-CE2）上采用 FP-1002-22 gDNA 165 kb 方法（快速法）或 FP-1002E22 擴(kuò)展 gDNA 165 kb 法（擴(kuò)展法），對(duì)提取的 gDNA 進(jìn)行分離。在 Femto Pulse 系統(tǒng)操作軟件中選擇基因組 DNA 165 kb 快速和擴(kuò)展法。將 50 ng/ L 左右 gDNA上樣至 0.8% 瓊脂糖凝膠（Lonza SeaKem Agarose，部件號(hào) 50152），并用 Pippin- Pulse 預(yù)設(shè)方案（ 5 至 150 kb）通過PFGE 分離 18 小時(shí) (Sage Sciences)。使用 Agilent FP 165 kb 分子量標(biāo)準(zhǔn)品（165、50、42、23、21、17.7、10 kb）（部件號(hào) FP-7002-U035）和低范圍 PFG 標(biāo)準(zhǔn)品（New England Biolabs，部件號(hào)N0350S）。分離后，用 Agilent FP 嵌入染料（部件號(hào) FP-6001-U030）對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行后染色，并用紫外透照儀觀察。
結(jié)果與討論
在 Femto Pulse 系統(tǒng)上用快速和擴(kuò)展基因組 DNA 165 kb 方法測(cè)定分子量分布
Femto Pulse 系統(tǒng)軟件為基因組 DNA165 kb 試劑盒提供了兩種分離方法。快速法是一種 70 分鐘的脈沖場(chǎng)毛細(xì)管電泳 (CE) 分離，最適合對(duì) 80 kb 以下的 gDNA 樣品進(jìn)行分離與分子量測(cè)定。擴(kuò)展法采用另一種持續(xù) 3.5 小時(shí)的脈沖場(chǎng) CE 分離方法，專用于改善大于 80 kb 的 gDNA 樣品的分離和分子量測(cè)定。用快速法分離的大于 80 kb 的基因組 DNA 峰形尖銳、緊湊，與 165 kb 左右 DNA 的片段峰形相似[3]。導(dǎo)致這一結(jié)果的部分原因?yàn)槊}沖場(chǎng)分離期間用于樣品分離的時(shí)間太短。擴(kuò)展法在更長的分離時(shí)間中使用了脈沖場(chǎng) CE 替代方法，并將相同 gDNA 樣品分離為更寬的彌散條帶，更能代表樣品的整體分子量范圍。擴(kuò)展法推薦用于大于 80 kb 的 gDNA 樣品（快速法僅能將其分離為 165 kb 左右的緊湊峰）。
Femto Pulse 系統(tǒng)使用基因組 DNA 165 kb擴(kuò)展法來分離大于 80 kb 的提取 gDNA（圖 1）。使用 Agilent ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件上的 Smear Analysis 選項(xiàng)卡分析gDNA 的分子量分布。彌散條帶分子量分布包含整個(gè)彌散條帶范圍內(nèi)的濃度分布。酵母 gDNA 的彌散條帶分子量分布和完整性隨使用的提取方法不同而變化。使用提取方法 A、B、C、D、E 得到的基因組 DNA 樣品的彌散條帶分子量依次減?。ū?1）。液相提取法 A 和 B 得到了分子量最大的完整 gDNA 彌散條帶。用傳統(tǒng)液體苯酚-氯仿提取法 (A) 提取的基因組 DNA 產(chǎn)生的完整 gDNA 較長，平均為163670 bp，而另一種液相提取方法 B 為
103111 bp。方法 C 離心柱 gDNA 提取方法和方法 D 膜 gDNA 提取方法，在五種不同提取方法中表現(xiàn)出相似的彌散條帶分子量分布結(jié)果。
在使用基因組 DNA 165 kb 擴(kuò)展法分析時(shí)，方法 E 離心柱 gDNA 提取方法得到的電泳圖顯示整個(gè) gDNA 樣品均分子量小于 80 kb。因此，將使用快速法和擴(kuò)展法分析的方法 E 樣品進(jìn)行對(duì)比（圖 2）。兩種方法對(duì)樣品 E 得到的彌散條帶分子量相近，為 30579 和 27388 bp（分別對(duì)應(yīng)于快速法和擴(kuò)展法）。在此示例中， 1 小時(shí)的快速法運(yùn)行時(shí)間更短，故優(yōu)于擴(kuò)展法。
Femto Pulse 系統(tǒng)與脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE) 的對(duì)比
過去，16 至 18 小時(shí)的 PFGE 分析是測(cè)定 50 kb 以上 gDNA 質(zhì)量和分子量的唯一選擇。隨著技術(shù)的進(jìn)步，F(xiàn)emto Pulse系統(tǒng)成為唯一一款能夠在短短 70 分鐘內(nèi)評(píng)估165 kb 以內(nèi) gDNA 分子量和質(zhì)量的儀器。用 Femto Pulse 系統(tǒng)取代過夜運(yùn)行的PFGE，省去了數(shù)天專門用于質(zhì)量控制檢查的時(shí)間，從而節(jié)省了時(shí)間和金錢。ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件自動(dòng)提供峰分子量、電泳圖和數(shù)字化膠圖，實(shí)現(xiàn)樣品質(zhì)量和分子量的快速測(cè)定。相比之下，PFGE運(yùn)行需要采用額外軟件進(jìn)行用戶評(píng)估，以獲得計(jì)算分子量值。此外，F(xiàn)emto Pulse系統(tǒng)將樣品起始量降至皮克級(jí)，節(jié)省了寶貴的樣品材料。
對(duì)于測(cè)試的所有提取方法，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)擴(kuò)展法與 PFGE 凝膠得到的 ProSize 數(shù)字化膠圖中的 gDNA 濃縮條帶區(qū)域具有相近的分子量（圖 3）。Femto Pulse 系統(tǒng)的高靈敏度使其能夠檢出因濃度低而無法在 PFGE 上檢出的完整 gDNA 彌散條帶范圍。此外，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)的出色分
辨率有助于區(qū)分用方法 B、C、D 提取的分子量相近的gDNA 樣品。
基因組質(zhì)量值 (GQN)
提取 DNA 的質(zhì)量會(huì)因?yàn)樘崛》椒?、樣品處理和組織類型的不同產(chǎn)生很大差異。因此，在使用樣品前通過質(zhì)量控制分析來確定高度完整的 gDNA 十分重要?；蚪M質(zhì)量值(GQN) 專為ProSize 設(shè)計(jì)，可以輕松
實(shí)現(xiàn)定制化的 gDNA 質(zhì)量評(píng)估。用戶可針對(duì)其特定應(yīng)用設(shè)定合適的分子量閾值。然后，ProSize 根據(jù)高于指定分子量閾值的總測(cè)量濃度分?jǐn)?shù)計(jì)算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等級(jí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)分，0 表示樣品均未超過閾值，10 表示 100% 的樣品高于閾值。
在需要分析不同分子量的 gDNA 時(shí)，能設(shè)置可自定義的 GQN 分子量閾值是一項(xiàng)巨大的優(yōu)勢(shì)。用戶可以根據(jù)具體樣品確定合適的分子量閾值，以便客觀判斷哪些樣品可滿足用戶要求。將方法 A、B、C、D、
E 提取的酵母 gDNA 的 GQN 分子量閾值設(shè)為 50 kb。隨著 gDNA 樣品分子量的減小，GQN 分別為 8.2、7.4、6.1、3.0、1.1（分別對(duì)應(yīng)于方法 A、B、C、D、E， 表 1），與預(yù)期相同。GQN 還表示高于分子量閾值的樣品百分比。例如，GQN 8.2 表示高于 50 kb 閾值的樣品占 82%。也就是說，有 18% 的樣品低于閾值。方法C 和 D 得到的分子量相近（分別為 77 和 62 kb），但得到的 GQN 分別為 6.1 和
3.0，差異很大。GQN 所反映出的差異主要是由于彌散條帶分布不同，因此相近平均分子量的 gDNA 的質(zhì)量水平不同。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應(yīng)用的樣品時(shí)，需要同時(shí)考慮樣品的分子量和質(zhì)量。
結(jié)論
Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)是唯一能夠替代HMW gDNA 過夜 PFGE 分析的自動(dòng)化系統(tǒng)，可以在 70 分鐘內(nèi)完成分析，大大節(jié)省時(shí)間和金錢。此外，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)將樣品起始量降至皮克級(jí)，節(jié)省了寶貴的樣品材料。Agilent ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件能夠報(bào)告用戶定義的 GQN 質(zhì)量評(píng)分，該評(píng)分客觀代表了每個(gè)樣品中 HMW gDNA 的百分比。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應(yīng)用的樣品時(shí)，同時(shí)需要考慮樣品分子量和質(zhì)量。使用 Femto Pulse 系統(tǒng)和安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒對(duì)比了通過不同方法提取的 DNA 樣品的分子量和質(zhì)量。與其他液相、離心柱和膜提取方法相比，傳統(tǒng)酚-氯仿提取方法得到的 gDNA 最長且最完整。Femto Pulse 系統(tǒng)具有極高的分辨率，可以區(qū)分平均分子量相近的 gDNA 樣品間的不同分子量分布，這是傳統(tǒng)PFGE 無法實(shí)現(xiàn)的功能。
參考文獻(xiàn)
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2019 年 3 月 5 日，中國出版
安捷倫科技（中國）有限公司，2019
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