《Cell Stem Cell》巧用單細(xì)胞測序解析生發(fā)過程的深層次調(diào)控機(jī)制 點(diǎn)擊次數(shù)：41 發(fā)布日期：2019-5-6 來源：本站 僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
傳統(tǒng)研究怎么用單細(xì)胞測序這把利劍:《Cell Stem Cell》解析生發(fā)過程的深層次調(diào)控機(jī)制

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序是這兩年來非常流行的高通量組學(xué)研究工具，然而，是不是所有的研究都適合用該方法？是不是所有的問題都可以通過該方法來解釋？這是一個(gè)值得探討的問題。從現(xiàn)有的研究報(bào)道來說，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究很好地解決了細(xì)胞圖譜，發(fā)育過程等重要的生物學(xué)問題。但是在相對比較傳統(tǒng)的研究方向，是否也能利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序方法來使研究更加深入和出色？

本期小編通過對近期發(fā)表在《Cell Stem Cell》上的文獻(xiàn)的重點(diǎn)內(nèi)容解析，來領(lǐng)略下生發(fā)機(jī)制研究中，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的巧妙運(yùn)用，如何為解釋內(nèi)在的生發(fā)關(guān)鍵時(shí)期的調(diào)控通路提供了直接證據(jù)。

研究背景

哺乳動物毛發(fā)生命周期是由毛囊（HF）經(jīng)歷了由生長期（anagen）,退化期（catagen）和休止期（telogen）為代表的三個(gè)重要精細(xì)調(diào)控階段。來自毛囊干細(xì)胞（HFSCs）的角質(zhì)細(xì)胞接受到如Wnt或者Shh等通路的激活信號后，會在生長期促進(jìn)細(xì)胞增殖；在休止期接受到如BMPs等抑制信號時(shí)，會促進(jìn)細(xì)胞靜止過程。

JAK-STAT通路調(diào)控休止期靜止的潛在上游調(diào)控信號被認(rèn)為是一些細(xì)胞因子家族的因子。制瘤素（OSM）顯示出抑制plucking誘導(dǎo)的生長期，而IL-6可以誘導(dǎo)毛囊從生長期進(jìn)去退化期。OSM和IL-6屬于gp130-dependent家族的一類細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)LIF，CT-1，CNTF的產(chǎn)生。在本研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)OSM抑制JAK-STAT通路誘導(dǎo)的毛發(fā)生長過程，可能是作為一種內(nèi)源的抑素維持休止期。通過進(jìn)一步的單細(xì)胞測序和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)OSM是由一類TREM2+的巨噬細(xì)胞在休止期早期產(chǎn)生來影響毛發(fā)生長周期的過程。

圖1 研究主要結(jié)果展示

研究主體

為研究OSM在毛發(fā)生長過程中的調(diào)控作用，本研究先進(jìn)行了一系列的傳統(tǒng)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，得到以下幾個(gè)結(jié)論：

1. OSM通過OMSR-JAK-STAT信號通路維持毛囊處于休止期；
2. OSMR 和其共受體gp130在早期和中期休止期時(shí)，在HFSCs細(xì)胞凸起與胚芽中，共定位激  活pSTAT5；
3. OSMRb信號通路的干擾縮短了第二個(gè)休止期周期；
4. 在休止期中期干擾OMSR 和STAT5表達(dá)促進(jìn)HFSC的增值和生長期起始；
5. 真皮細(xì)胞中的OSM來源于休止期組織中的巨噬細(xì)胞；
6. 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的OSM在體外能抑制HFSC的增殖；
通過以上的實(shí)驗(yàn)，該研究已經(jīng)打通了OSM影響生發(fā)過程中的重要調(diào)控過程以及OSM的主要來源問題，應(yīng)該來說是傳統(tǒng)生物分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)操作。但是，該研究沒有將結(jié)論停留于此，運(yùn)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序手段，該研究繼續(xù)往前走了一大步。

那么運(yùn)用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，研究人員到底做了些什么，發(fā)現(xiàn)了什么呢？

7. 真皮中CD4+免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

研究人員對休止期早（P45）中（P50，P63）晚（P80）三個(gè)時(shí)期的真皮CD45+免疫細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（10XGenomics平臺）。分析顯示，P45時(shí)期的細(xì)胞共分成13個(gè)不同的Cluster。利用已有的巨噬細(xì)胞markers CD68，F(xiàn)4/80（Adgre1）和Csf1r，P45期巨噬細(xì)胞重新細(xì)分到其中的5個(gè)不同的cluster中：0，1，2，5，11。而OSM主要是在Cluster11中表達(dá)豐度較高。

圖2 單細(xì)胞測序結(jié)果tSNE細(xì)胞分類結(jié)果 為進(jìn)行更加精細(xì)的分類，研究人員對由巨噬細(xì)胞marker表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行了重新分類，共產(chǎn)生7個(gè)新的分類亞群。這些巨噬細(xì)胞簇顯示出相對均一的CD68表達(dá)，但相對于經(jīng)典炎癥和抗炎標(biāo)記物是異質(zhì)的。其中，Cluster 3主要表達(dá)抗炎癥marker Mrc2(CD206)和CD163，而Cluster 0和1主要表達(dá)炎癥marker IL-1b和MHC II（H2-Ab1）。值得注意的是，OSM主要局限性地在新分類中的Cluster 6中表達(dá)。

8. 產(chǎn)生OSM的巨噬細(xì)胞是TREM2+且有著獨(dú)特的基因表達(dá)譜

通過對每個(gè)cluster中的顯著上調(diào)基因進(jìn)行聚類，可以發(fā)現(xiàn)Cluster 6 細(xì)胞和 M2-like 的Cluster3表達(dá)模式很相似。有意思的是，這兩類細(xì)胞可以用TREM2 marker區(qū)分來開，TREM2特異性地在生產(chǎn)OSM的Cluster 6中表達(dá)。

利用在線資源Enrichr對cluster 6的基因分析發(fā)現(xiàn)，其功能主要與小神經(jīng)膠質(zhì)相關(guān)，是中樞神經(jīng)的長期組織駐留巨噬細(xì)胞。小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)的marker（Apoe,Aif-1,Cx3cr1和Tmem119）都在該類細(xì)胞中由表達(dá)。因此，OSM和TREM2是culster 6中特異性高表達(dá)的基因。

圖3 產(chǎn)生OSM的巨噬細(xì)胞的表達(dá)特征譜

9. TREM2+巨噬細(xì)胞與HFSCs關(guān)系密切

研究人員對小鼠真皮組織選取30 m組織塊進(jìn)行markers免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)Aif-1和CD11b與OSM在P45期的毛囊免疫細(xì)胞中共定位；TREM2和F4/80與OSM在靠近休止期HFSCs的巨噬細(xì)胞中共定位。這部分的結(jié)果表明，OSM由處于休止期HFs中的TREM2+巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。

10. 休止期后TREM2+巨噬細(xì)胞會減少

如果TREM2+巨噬細(xì)胞抑制HFSC的增值，那么在下一輪的生長期之前應(yīng)該會減少。為驗(yàn)證這樣的假設(shè)，研究人員對休止期的三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。結(jié)果顯示，隨著休止期過程的發(fā)展，CD45+免疫細(xì)胞的多樣性逐漸減少，從P45的13類減少到P63的3類。且產(chǎn)生OSM的細(xì)胞類群由P45到P50時(shí)，也變少了，在P63和P80更加減少。這樣的結(jié)果通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)也得到了驗(yàn)證。對OSM和小膠質(zhì)細(xì)胞markers的軌跡分析也顯示，休止期它們的表達(dá)持續(xù)減少。因此，休止期，TREM2+巨噬細(xì)胞通過產(chǎn)生OSM，影響OSMR -STAT5信號通路，維持HFSC細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)。

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)免疫細(xì)胞特征及OSM調(diào)控模式圖

通過以上分析，該研究不光找到了OSM怎么影響休止期過程，也發(fā)現(xiàn)了OSM真正的產(chǎn)生來源是一類TREM2+巨噬細(xì)胞。后期，在休止期通過遺傳學(xué)手段，抗體中和和小分子抑制劑抑制巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以有效誘導(dǎo)生長期過程。

以上是該研究的主要內(nèi)容及單細(xì)胞研究過程中的重點(diǎn)解析。可以看到，該研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)，一方面解釋了OSM到底是由哪一類特定的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生而來；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了OSM在休止期三個(gè)不同階段的變化過程，可以說巧妙地將單細(xì)胞技術(shù)非常完美地利用了起來。因此，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)，只要能進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和規(guī)劃，相信廣大的研究中都可以利用起來。
參考文獻(xiàn)：Wang, E.C.E., et al., A Subset of TREM2(+) Dermal Macrophages Secretes oncostatin M to Maintain Hair Follicle Stem Cell Quiescence and Inhibit Hair Growth. Cell Stem Cell, 2019. 24(4): p. 654-669 e6.
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