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Western blot是生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種蛋白分析方法，其技術(shù)環(huán)節(jié)多，操作時(shí)間長，哪一步出現(xiàn)問題，都會(huì)影響最后的結(jié)果，今天小編總結(jié)了WB中印跡膜和凝膠中出現(xiàn)的問題及解決方案，希望可以幫助在WB中苦惱的小伙伴。
問題：波浪式的環(huán)繞條帶
引起原因：轉(zhuǎn)印不均勻
解決方法：當(dāng)組裝三明治結(jié)構(gòu)時(shí)，要確保轉(zhuǎn)印堆疊各部分緊密地連接在一起?？赡苄枰鼡Q海綿墊，以達(dá)到適合的松緊度。
問題:條帶是波浪型的，微笑的，歪斜的
引起原因：
1.在樣本中可能有細(xì)胞碎片或者DNA
2.上樣buffer不新鮮或者含有太多鹽成分。
3.運(yùn)行凝膠太快，導(dǎo)致凝膠升溫，降解聚合物。
解決方法：
1.增加超聲步驟
2.延長加熱時(shí)間
3.離心
4.嘗試準(zhǔn)備新鮮的緩沖液，使用不同類型的緩沖液，或通過稀釋、透析/微透析或色譜法降低樣品緩沖液的鹽濃度。
6.選擇適當(dāng)?shù)木彌_液
7.設(shè)置適當(dāng)?shù)碾娏鞑⒈３值碗妷?br>
問題：泳道內(nèi)有多個(gè)蛋白條帶
引起原因：
1.封閉不完全
2.一抗特異性低
3.一抗?jié)舛冗^高
解決方法：
1.更換封閉液。許多常用的封閉液可能屏蔽目標(biāo)上的表位，使其難以檢測。封閉不完全，非特異性結(jié)合到不相關(guān)的裂解蛋白。用商業(yè)的封閉劑代替牛奶可以減少非特異性結(jié)合，同時(shí)增強(qiáng)抗體與抗原的相互作用。
2.純化一抗或者更換抗體
3.增加一抗的稀釋比例或者孵育時(shí)間，4度孵育可以減少非特異性結(jié)合 問題：剝離的印跡膜仍有條帶
引起原因：剝離不完全
解決方法：
1.優(yōu)化剝離條件，增加剝離時(shí)間，需要確保印跡膜完全淹沒在剝離緩沖液中，并在搖床上充分搖動(dòng)。
2.另一個(gè)需要考慮的解決方案是使用熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行多重Western blot。使用熒光檢測，您可以檢測多達(dá)四種不同的信號(hào)，這取決于您的檢測系統(tǒng)。
問題：氣泡
引起原因：
1.膜和凝膠之間有氣泡。
2.一抗與印跡接觸不足。
解決方法：
1.當(dāng)進(jìn)行三明治組裝時(shí)，要注意完全清除印跡膜和凝膠之間的空氣。使用玻璃棒或塑料吸管輕輕地把夾在印跡膜薄膜和凝膠之間的空氣擠出來。
2.增加一抗孵育液的體積，并在孵育步驟中驗(yàn)證溶液是否完全覆蓋膜。孵育盤應(yīng)該足夠大，使印跡膜可以移動(dòng).
問題：高背景
引起原因：
1.封閉不充分
2.漂洗不充分
2. 一抗?jié)舛冗^高
解決方法：
1.更換封閉液。許多常用的封閉液可能屏蔽目標(biāo)上的表位，使其難以檢測。封閉不完全，非特異性結(jié)合到不相關(guān)的裂解蛋白。用商業(yè)的封閉劑代替牛奶可以減少非特異性結(jié)合，同時(shí)增強(qiáng)抗體與抗原的相互作用。
2.增加漂洗次數(shù)或洗滌時(shí)間。此外，增加漂洗劑的用量或使用更強(qiáng)的漂洗劑，如SDS或NP-40，可以進(jìn)一步降低背景。
3.增加一抗的稀釋或增加孵育時(shí)間，如果必要，4 C孵育可減少非特異性抗體的結(jié)合。
問題：熒光western blot的高背景
引起原因：
1.NC膜和某些類型的PVDF膜有自發(fā)熒光，導(dǎo)致高背景信號(hào)。
2. 濕膜成像
3. 一抗?jié)舛冗^高導(dǎo)致高背景
4. 漂洗不充分
解決方法：
1.使用低熒光背景膜
2.成像前用甲醇將膜干燥。當(dāng)印跡膜干時(shí)，膜上的自發(fā)熒光減少，熒光基團(tuán)發(fā)出的特異性信號(hào)變亮
3.增加一抗的稀釋或增加孵育時(shí)間，如果必要，4 C孵育可減少非特異性抗體的結(jié)合
4.增加漂洗次數(shù)或洗滌時(shí)間。此外，增加漂洗劑的用量或使用更強(qiáng)的漂洗劑，如SDS或NP-40，可以進(jìn)一步降低背景。 問題：Marker太亮
引起原因：Marker上樣量太多
解決方法：
1.增加Marker的稀釋。大多數(shù)Marker在IR 700通道內(nèi)有自發(fā)熒光，這便于在熒光western blot中測定條帶的分子量。然而，如果你已經(jīng)習(xí)慣了使用化學(xué)發(fā)光Western blot，那么你的Marker可能上樣量過多 我們建議在熒光Western blot上使用大約十分之一的分子量marker。
2.我們建議用非熒光的、干凈的、不透明的材料覆蓋強(qiáng)條帶。
引起原因：轉(zhuǎn)印不均勻
解決方法：當(dāng)組裝三明治結(jié)構(gòu)時(shí)，要確保轉(zhuǎn)印堆疊各部分緊密地連接在一起?？赡苄枰鼡Q海綿墊，以達(dá)到適合的松緊度。
問題:條帶是波浪型的，微笑的，歪斜的
引起原因：
1.在樣本中可能有細(xì)胞碎片或者DNA
2.上樣buffer不新鮮或者含有太多鹽成分。
3.運(yùn)行凝膠太快，導(dǎo)致凝膠升溫，降解聚合物。
解決方法：
1.增加超聲步驟
2.延長加熱時(shí)間
3.離心
4.嘗試準(zhǔn)備新鮮的緩沖液，使用不同類型的緩沖液，或通過稀釋、透析/微透析或色譜法降低樣品緩沖液的鹽濃度。
6.選擇適當(dāng)?shù)木彌_液
7.設(shè)置適當(dāng)?shù)碾娏鞑⒈３值碗妷?br>
問題：泳道內(nèi)有多個(gè)蛋白條帶
引起原因：
1.封閉不完全
2.一抗特異性低
3.一抗?jié)舛冗^高
解決方法：
1.更換封閉液。許多常用的封閉液可能屏蔽目標(biāo)上的表位，使其難以檢測。封閉不完全，非特異性結(jié)合到不相關(guān)的裂解蛋白。用商業(yè)的封閉劑代替牛奶可以減少非特異性結(jié)合，同時(shí)增強(qiáng)抗體與抗原的相互作用。
2.純化一抗或者更換抗體
3.增加一抗的稀釋比例或者孵育時(shí)間，4度孵育可以減少非特異性結(jié)合 問題：剝離的印跡膜仍有條帶
引起原因：剝離不完全
解決方法：
1.優(yōu)化剝離條件，增加剝離時(shí)間，需要確保印跡膜完全淹沒在剝離緩沖液中，并在搖床上充分搖動(dòng)。
2.另一個(gè)需要考慮的解決方案是使用熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行多重Western blot。使用熒光檢測，您可以檢測多達(dá)四種不同的信號(hào)，這取決于您的檢測系統(tǒng)。
問題：氣泡
引起原因：
1.膜和凝膠之間有氣泡。
2.一抗與印跡接觸不足。
解決方法：
1.當(dāng)進(jìn)行三明治組裝時(shí)，要注意完全清除印跡膜和凝膠之間的空氣。使用玻璃棒或塑料吸管輕輕地把夾在印跡膜薄膜和凝膠之間的空氣擠出來。
2.增加一抗孵育液的體積，并在孵育步驟中驗(yàn)證溶液是否完全覆蓋膜。孵育盤應(yīng)該足夠大，使印跡膜可以移動(dòng).
問題：高背景
引起原因：
1.封閉不充分
2.漂洗不充分
2. 一抗?jié)舛冗^高
解決方法：
1.更換封閉液。許多常用的封閉液可能屏蔽目標(biāo)上的表位，使其難以檢測。封閉不完全，非特異性結(jié)合到不相關(guān)的裂解蛋白。用商業(yè)的封閉劑代替牛奶可以減少非特異性結(jié)合，同時(shí)增強(qiáng)抗體與抗原的相互作用。
2.增加漂洗次數(shù)或洗滌時(shí)間。此外，增加漂洗劑的用量或使用更強(qiáng)的漂洗劑，如SDS或NP-40，可以進(jìn)一步降低背景。
3.增加一抗的稀釋或增加孵育時(shí)間，如果必要，4 C孵育可減少非特異性抗體的結(jié)合。
問題：熒光western blot的高背景
引起原因：
1.NC膜和某些類型的PVDF膜有自發(fā)熒光，導(dǎo)致高背景信號(hào)。
2. 濕膜成像
3. 一抗?jié)舛冗^高導(dǎo)致高背景
4. 漂洗不充分
解決方法：
1.使用低熒光背景膜
2.成像前用甲醇將膜干燥。當(dāng)印跡膜干時(shí)，膜上的自發(fā)熒光減少，熒光基團(tuán)發(fā)出的特異性信號(hào)變亮
3.增加一抗的稀釋或增加孵育時(shí)間，如果必要，4 C孵育可減少非特異性抗體的結(jié)合
4.增加漂洗次數(shù)或洗滌時(shí)間。此外，增加漂洗劑的用量或使用更強(qiáng)的漂洗劑，如SDS或NP-40，可以進(jìn)一步降低背景。 問題：Marker太亮
引起原因：Marker上樣量太多
解決方法：
1.增加Marker的稀釋。大多數(shù)Marker在IR 700通道內(nèi)有自發(fā)熒光，這便于在熒光western blot中測定條帶的分子量。然而，如果你已經(jīng)習(xí)慣了使用化學(xué)發(fā)光Western blot，那么你的Marker可能上樣量過多 我們建議在熒光Western blot上使用大約十分之一的分子量marker。
2.我們建議用非熒光的、干凈的、不透明的材料覆蓋強(qiáng)條帶。
