背景扣除對(duì)于有效定量是必不可少的。 例如，AzureSpot有五個(gè)自動(dòng)后臺(tái)選項(xiàng)和三個(gè)手動(dòng)選項(xiàng)。

   如果背景不均勻，請(qǐng)使用 Rolling Ball。 類似指定半徑的圓盤在泳道輪廓下 滾動(dòng) ，對(duì)信號(hào)求平均，從而產(chǎn)生平滑小的變化。 半徑越大，滾動(dòng)越平滑。

 如果輪廓的末端與輪廓的其余部分沒有太大差異，請(qǐng)使用Rubber Band。 這種方法就像在泳道輪廓下拉伸橡皮筋一樣。謹(jǐn)慎使用此方法，在泳道邊緣找到最低點(diǎn)，繪制泳道稍微不同，值就會(huì)發(fā)生變化。通常，這種計(jì)算方法很難做重復(fù)分析。
 
   如果您已經(jīng)執(zhí)行了條帶檢測(cè)，則可以使用Valley to Valley，它使用每個(gè)條帶的邊緣來(lái)確定和減去背景。 輸入最大斜率非常重要，以避免將重疊條帶之間的邊緣識(shí)別為背景。
   Minimum Profile方法是將最小值將設(shè)置為背景
   LaneEdge Subtraction使用每個(gè)泳道邊緣的兩個(gè)值中的較低值作為背景。
 
歸一化
  AzureSpot可以通過三種方式執(zhí)行歸一化。 首先，它可以設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)凝膠中泳道中特定條帶的歸一化。 在多重凝膠中，它可以用看家蛋白或總蛋白質(zhì)歸一化。
  總蛋白歸一化（TPN）變得越來(lái)越普遍，因?yàn)樗哂懈叩臏?zhǔn)確性和對(duì)定量蛋白印跡的適應(yīng)性。 如果您已經(jīng)驗(yàn)證了您的看家蛋白的表達(dá)沒有改變，那么它可能是合適的。 否則，TPN是首選。

在轉(zhuǎn)印后免疫檢測(cè)之前用總蛋白質(zhì)染劑（例如AzureRed熒光總蛋白染劑）染膜。 該方法不依賴于抗體，并且考慮了樣品蛋白質(zhì)加載和轉(zhuǎn)移效率的變化。

  不要忘記使用稀釋系列來(lái)確認(rèn)線性檢測(cè)范圍，這可確保信號(hào)強(qiáng)度與樣品量成正比

  AzureSpot執(zhí)行歸一化。 紫色線始終是背景，綠色線之上將是信號(hào)。 首先選擇一條泳道作為參考泳道（或標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)）。 對(duì)于每個(gè)泳道，計(jì)算歸一化因子即泳道中所有條帶的灰度值除以參考泳道中的所有條帶的灰度值。 接下來(lái)計(jì)算所有通道中的歸一化值，即條帶的原始灰度值除以歸一化因子。

(LNF:歸一化因子 TPS:總蛋白染色)

  在整個(gè)凝膠上加入相同量的蛋白質(zhì)樣品。 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定可以幫助確定是否需要調(diào)整濃度。

 Examples of signal intensity for different proteins at different concentrations (Ghosh, et al. 2014

  在歸一化之前確保您的上樣量處于線性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，此范圍因濃度而異

  通過有效的背景扣除和總蛋白歸一化，您將可對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行有效的定量分析。