原生質(zhì)體電子顯微鏡觀察鑒別實(shí)驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用

在溶壁酶的作用下，將真菌的細(xì)胞壁溶解，不同的真菌、同一種真
菌不同的菌態(tài)以及同一菌絲體不同部位的細(xì)胞的細(xì)胞壁的成分、厚
度皆不相同。相對薄弱的部位最先解體，形成孔洞，釋放原生質(zhì)體
。當(dāng)溶壁酶開始對細(xì)胞壁發(fā)生作用時，細(xì)胞膜上的釋別信號就對這
一外部作用作出了精確的反應(yīng)，質(zhì)膜收縮，發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象，并
形成具有再生能力的原生質(zhì)體。其目的就是分離到數(shù)量多、生活能
力強(qiáng)的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體分離技術(shù)包括最佳分離條件的選擇、鑒
別方法、保藏方法等。

  隨真菌種類的不同，最佳分離條件的選擇也不同，大體上包括
如下技術(shù)：預(yù)處理，培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)方法，菌態(tài)和菌齡，
溶壁酶的種類、濃度和配比，酶解方法，酶解溫度，酶解時間，滲
透壓穩(wěn)定劑的種類、濃度等。
  鑒別方法和技術(shù)包括：原生質(zhì)體計(jì)數(shù)方法、活力鑒別技術(shù)，細(xì)
胞核染色技術(shù)，原生質(zhì)體電子顯微鏡觀察技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)小室應(yīng)用
技術(shù)，DNA分離與純化技術(shù)，染色體DNA測定技術(shù)，熒光素標(biāo)記技術(shù)
等。 
  保藏方法和技術(shù)包括：超低溫保藏技術(shù)和低溫藏油法保藏技術(shù)
。
  原生質(zhì)體融合的原理和技術(shù)
  真菌的原生質(zhì)體融合是指雙親原生質(zhì)體，在化學(xué)助融合劑、電
脈沖和激光束等誘導(dǎo)下相互融合。根據(jù)親本性質(zhì)的不同，將原生質(zhì)
體融合分為原生質(zhì)體與原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體與細(xì)胞核和染色體
的融合以及原生質(zhì)體對細(xì)胞器的攝取。根據(jù)誘導(dǎo)原生質(zhì)雜交因子的
性質(zhì)不同，將原生質(zhì)體融合分為化學(xué)融合、物理融合和生物融合三
大類。根據(jù)融合親本親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，將真菌原生質(zhì)體融合分為近緣
原生質(zhì)體融合和遠(yuǎn)緣原生質(zhì)體融合兩大類。當(dāng)前真菌細(xì)胞工程學(xué)中
應(yīng)用最廣的原生質(zhì)體融合技術(shù)為聚乙二醇(PEG)誘導(dǎo)的化學(xué)融合和
電脈沖誘導(dǎo)的電融合。

  融合的機(jī)制：膜融合是一種非常重要的生物學(xué)現(xiàn)象，也是生物
界普遍存在的一種現(xiàn)象如受精、胞飲、吞噬、菌絲融合等。這一細(xì)
胞及亞細(xì)胞水平事件涉及細(xì)胞的內(nèi)吞、外排及與外界交換物質(zhì)、能
量等。膜的融合是原生質(zhì)融合非常關(guān)鍵的一個步驟。隨著各種誘導(dǎo)
因子的發(fā)現(xiàn)，各種膜誘導(dǎo)模型也隨之建立，“局部脫水與膜融合”
模型更多地被人們所接受。也有人提出原生質(zhì)體融合是由于膜表面
電荷誘導(dǎo)融合的模式。PEG誘導(dǎo)的原生質(zhì)體融合機(jī)制有：原生質(zhì)體
局部脫水，改變了質(zhì)膜內(nèi)外的電位差，以分子橋形式溝通兩原生質(zhì)
膜和改變膜的流動性，質(zhì)膜蛋白質(zhì)顆粒凝聚等。電脈沖誘導(dǎo)的原生
質(zhì)體融合機(jī)制有電介質(zhì)電泳、穩(wěn)定的膜接觸、可逆電擊穿、串珠形
成等。無論是PEG誘導(dǎo)的融合，或者電泳沖誘導(dǎo)的融合，脫去細(xì)胞
膜表面的結(jié)合水都是必需的步驟。由于原生質(zhì)體先發(fā)生了膜融合的
關(guān)鍵步驟，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核融合才有可能進(jìn)行。原生質(zhì)體融合過程
不僅僅是一個復(fù)雜的物理化學(xué)過程，而且也是一個復(fù)雜的生命活動
過程。對于融合的機(jī)制，還有許多問題不清楚，尚待深人研究。

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