2018?年，關(guān)于腫瘤免疫的那些事兒

6?月：國(guó)內(nèi)首款?PD-1?單克隆抗體藥物獲批，中國(guó)跨入腫瘤免疫時(shí)代

10?月：諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予美國(guó)科學(xué)家詹姆斯·艾利森? (James Allison)??與日本科學(xué)家本庶佑??(Tasuku Honjo)?，以表彰他們?cè)诎┌Y免疫治療方面所做出的貢獻(xiàn)

12?月：國(guó)內(nèi)首款國(guó)產(chǎn)?PD-1?單克隆抗體藥物獲批，開(kāi)啟腫瘤免疫治療“親民”時(shí)代

腫瘤免疫治療的火爆讓單克隆抗體藥物（下文簡(jiǎn)稱單抗）的研究越來(lái)越受到關(guān)注，今天我們就來(lái)聊聊單抗的一大特性——電荷異質(zhì)性。

抗體是指能與相應(yīng)抗原特異結(jié)合的具有免疫活性的球蛋白，而單抗是由單一?B?細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體。同其它蛋白一樣，單抗常常存在廣泛的翻譯后修飾和降解，如糖基化、碳端賴氨酸丟失、脫酰胺化、二硫鍵錯(cuò)配、糖化和氧化等。幾乎這些所有的翻譯后修飾都會(huì)直接或間接的引起單抗表面電荷的變化，這就是單抗的電荷異質(zhì)性。電荷異質(zhì)性影響單抗的體外及體內(nèi)的活性、安全性、可行性和質(zhì)量，在新藥研發(fā)和生物類似藥的開(kāi)發(fā)中都非常重要。

電荷異質(zhì)性的檢測(cè)通常采用基于電荷分離的技術(shù)手段，如離子交換色譜、毛細(xì)管等電聚焦（CIEF），以及成像毛細(xì)管等電聚焦（iCIEF）等。與主峰? (Main peak)? 相比，這些變異體峰通常被稱為酸性峰? (Acidic variants)? 和堿性峰? (Basic variants) 。大部分的人源 IgGs 具有堿性的等電點(diǎn)，因此，陽(yáng)離子交換色譜通常被用于分離。在主峰前面的峰通常稱為酸性峰，因?yàn)槠鋷в械恼姾奢^少，洗脫較快；在主峰后面的峰稱為堿性峰。酸堿峰的鑒定采用離線收集鑒定或多維液相-質(zhì)譜聯(lián)機(jī)在線鑒定。

圖 1. 陽(yáng)離子交換色譜分離酸堿峰示例圖

毛細(xì)管等電聚焦（CIEF）是電荷異質(zhì)性表征的主要手段，但采用?CIEF?分離時(shí)收集餾分用于鑒定非常困難，所以?CIEF?通常用于監(jiān)控電荷異質(zhì)性而不能用于表征。質(zhì)譜檢測(cè)雖然廣泛應(yīng)用于單抗的表征，但是將?CIEF?和?MS?聯(lián)機(jī)一直是非常大的挑戰(zhàn)。質(zhì)譜在線檢測(cè)的缺失也限制了?CIEF?在蛋白電荷異質(zhì)性的表征上的應(yīng)用。將?CIEF?分離的高分辨特性和質(zhì)譜的表征能力結(jié)合起來(lái)是電荷異質(zhì)性表征迫切需要的技術(shù)。

Agilent 7100 CE-QTOF?聯(lián)機(jī)的特點(diǎn)

無(wú)與倫比的毛細(xì)管分離的分辨率：甘油改性劑降低非?CIEF?電泳遷移和區(qū)帶展寬

兩性電解質(zhì)：兼顧電泳分辨率和質(zhì)譜靈敏度

質(zhì)譜友好的陽(yáng)極液和陰極液

優(yōu)化的鞘流液組成：有效的聚焦、遷移和電噴霧離子化

納流級(jí)別的鞘流液流速：基于電滲流技術(shù)的納流鞘流液最大限度提高檢測(cè)靈敏度

優(yōu)化的?CIEF?運(yùn)行參數(shù)：進(jìn)樣量、電場(chǎng)強(qiáng)度、壓力

靈敏度高、抗污染的質(zhì)譜：Agilent 6200?系列?TOF，6500?系列?Q-TOF

圖 2.??Agilent 7100 CE-QTOF?聯(lián)機(jī)圖

CIEF-MS 的方法可行性及卓越表現(xiàn)

采用等電點(diǎn)標(biāo)記物（pI markers）進(jìn)行驗(yàn)證，等電點(diǎn)和遷移時(shí)間之間具有良好的線性相關(guān)性?(R^2=0.99)。此外，CIEF-MS?方法采集的四種單抗的電荷變異體分離的輪廓圖也通過(guò)成像毛細(xì)管等電聚焦紫外方法比對(duì)驗(yàn)證一致。pI markers?的絕對(duì)遷移時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于?5%（n=4）。貝伐單抗三次進(jìn)樣的相對(duì)遷移時(shí)間?RSD?小于?1%，絕對(duì)遷移時(shí)間小于?2.3%，峰面積的?RSD?小于?7%。并且，單抗的電荷變異體可通過(guò)質(zhì)譜直接測(cè)得其分子量。

CIEF-MS?采集的電荷變異體輪廓分布和?iCIEF-UV?檢測(cè)具有高度的一致性。iCIEF-UV?通過(guò)全柱成像檢測(cè)去除了等電聚焦后分析物遷移到檢測(cè)器端的步驟，CIEF-MS?和?iCIEF-UV?檢測(cè)結(jié)果的高度一致性證明了在線?CIEF-MS?分析單抗電荷變異體史無(wú)前例的高分辨率。除了高分辨率之外，該方法具有非常好的重現(xiàn)性。

CIEF-MS?電荷異質(zhì)性分析的應(yīng)用實(shí)例大集結(jié)

貝伐珠單抗的分析

CIEF-MS?和?iCIEF-UV?分析得到的酸堿峰比例接近，分別為酸性峰:?主峰:?堿性峰= 23% : 72% : 5%?和?27% : 68% : 5%。除了?CE?的高分離度之外，質(zhì)譜數(shù)據(jù)優(yōu)異的原始譜圖是實(shí)驗(yàn)分析制勝的關(guān)鍵，尤其是在鑒定跟主峰質(zhì)量差別很小的變異體時(shí)，如在分析一個(gè)脫酰胺??(+1Da)??質(zhì)量差時(shí)，一款性能優(yōu)異的質(zhì)譜是?CIEF-MS?分析的必備之選。

貝伐珠單抗的主峰分子量為?149 202 Da，堿性峰?B1?和主峰之間的質(zhì)量差為?+128 Da，和碳端賴氨酸?(+128 Da, +1K)??異質(zhì)性匹配；堿性峰?B2 (?=-17Da)??和氮端焦谷氨酸環(huán)化修飾?(-17Da)??匹配；酸性峰?A1 (?= 1Da)??和脫酰胺修飾匹配。酸性峰?A1?和主峰只有?1 Da?的質(zhì)量差別，雖然我們會(huì)擔(dān)心質(zhì)譜準(zhǔn)確度因素帶來(lái)的不確定性，但酸性峰的位置和正好?1 Da?的質(zhì)量差讓我們有理由相信酸性峰?A1?是脫酰胺的修飾峰。A2?峰的信號(hào)非常弱，可能是高糖基化修飾的峰。

圖 3. 貝伐珠單抗?CIEF-MS?分析結(jié)果圖

曲妥珠單抗的分析

曲妥珠單抗和貝伐珠單抗的電荷異質(zhì)性分布的差異較大。iCIEF-UV 測(cè)得的低含量堿峰在CIEF-MS上未檢出，同時(shí)其對(duì)酸峰的分離效果也優(yōu)于 CIEF-MS 分離。質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果清晰的展示了酸性峰中四種主要的糖型變異體。曲妥珠單抗的主峰分子量為148 224 Da，酸性峰 A1 (?m = +1Da) 和酸性峰 A2 (?m = +2Da) 和脫酰胺修飾匹配，并且和 2D CZE-MS 的結(jié)果一致。

圖 4. 曲妥珠單抗?CIEF-MS?分析結(jié)果圖

英夫利昔單抗的分析

英夫利昔單抗的三個(gè)電荷變異體峰在?CIEF-MS?上有良好的分離。解卷積結(jié)果顯示兩個(gè)堿峰為碳端賴氨酸變異體，堿性峰?B1 (?m = +258 Da)?和兩個(gè)賴氨酸匹配；堿性峰?B2 (?m = +129 Da)?和一個(gè)賴氨酸匹配；酸性峰?A (?m = +5 Da)?小的質(zhì)量偏差顯示其可能為脫酰胺的修飾。

圖 5. 英夫利昔單抗?CIEF-MS?分析結(jié)果圖

西妥昔單抗的分析

西妥昔單抗是人鼠嵌合的?IgG-1?單抗，具有高度的微觀不均一性，該特性主要源于高度復(fù)雜的糖基化修飾。西妥昔單抗重鏈的?Fab?和?Fc?上各有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，同時(shí)有碳端賴氨酸的不完全剪切，這些高度的異質(zhì)性會(huì)造成分離上的困難。采用?CIEF-MS?實(shí)現(xiàn)了八個(gè)電荷變異體的良好分離，不僅和?iCIEF-UV?的結(jié)果一致，同時(shí)也和文獻(xiàn)報(bào)道一致。但是由于西妥昔單抗復(fù)雜的糖基化修飾，通過(guò)質(zhì)譜獲得的分子量信息不足以反應(yīng)修飾的情況。

圖 6. 西妥昔單抗?CIEF-MS?分析結(jié)果圖

西妥昔單抗亞基水平的分析

針對(duì)西妥昔單抗這類具有復(fù)雜異質(zhì)性的抗體，通過(guò)?IdeS?酶切和?DTT?還原降低其復(fù)雜程度，更利于質(zhì)譜檢測(cè)。通過(guò)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，IdeS?酶切后的八個(gè)變異體峰及?IdeS?酶切同時(shí)?DTT?還原后得到的?11?個(gè)變異體都得以檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，西妥昔單抗的電荷異質(zhì)性主要源于?Fc?區(qū)末端賴氨酸的異質(zhì)性、Fd’ 區(qū)?N-羥乙酰神經(jīng)氨酸和可能存在的脫酰胺修飾。輕鏈上未發(fā)現(xiàn)有電荷異質(zhì)性。

圖 7. 亞基水平?CIEF-MS?分析流程圖

安捷倫?CE-QTOF?解決方案不僅兼顧了毛細(xì)管電泳的高效分離，離子源接口的高靈敏度和高分離度，也實(shí)現(xiàn)了質(zhì)譜的高靈敏高分辨檢測(cè)。在完整蛋白分析的層次上增加亞基水平的解決方案，即使是具有高度復(fù)雜異質(zhì)性的抗體分析也能輕松應(yīng)對(duì)。

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參考文獻(xiàn)：

1. 安捷倫應(yīng)用文獻(xiàn)?5994-0672EN

2. Jun Dai,*,? Jared Lamp,? QiangweiXia,? and Yingru Zhang?, Capillary Isoelectric Focusing-Mass SpectrometryMethod for the Separation and Online characterization of Intact Monoclonal AntibodyCharge Variants. Anal Chem. 2018 Feb 6;90(3):2246-2254

3. Jun Dai, and Yingru Zhang, AMiddle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometryfor In-depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal. Chem.,2018, 90 (24), pp 14527–14534

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